副溶血弧菌是水产养殖以及海鲜产品中的常见的主要病原Terpenoid biosynthesis菌,目前检测仍缺乏快速准确的免疫分析方法。细菌外膜蛋白具有良好的抗原性以及表面暴露性,是作为抗原的良好选择,OmpA是革兰氏阴性菌最主要的外膜蛋白之一,丰度较高。已有研究表明副溶血弧菌OmpA蛋白可以制备识别菌体的抗血清,但血清的交叉反应情况并不清楚。本文以副溶血弧菌的OmpA蛋白为研究对象,制备了OmpA重组蛋白和OmpA多肽作为免疫原,对其免疫原性进行研究。根据GenBank公布的副溶血弧菌外膜蛋白OmpA的基因(gi＿28897538)PD0325901半抑制浓度序列,设计相应的引物,并在引物两端插入酶切位点Bam HI和Xho I。使用质粒p ET-32a作为构建重组质粒的载体。将从副溶血弧菌(CICC 21618)中PCR扩增出的目的片段(977bp)与质粒p ET-32a酶切后,经T4连接酶连接构建重组质粒p ET-32a-OmpA,将重组质粒转至E.coli DH5α进行扩增后转化入E.coli BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白OmpA以可溶的形式进行表达,经亲和层析纯化后得到了His-OmpA重组蛋白(40k Da左MAPK抑制剂右)。通过NCBI的BLAST工具对副溶血弧菌OmpA的氨基酸序列与弧菌属内的菌株序列进行比对分析,对比部分弧菌的序列相似性在80%以上。再结合软件Meg Align、Protean、以及Py MOL软件进行同源性、特异性、疏水性以及多肽在蛋白上的位点分析,得到一条具有亲水性且位于OmpA蛋白膜外区域的多肽序列(SNNVSKAAG)。使用Sulfo-SMCC偶联剂对多肽与BSA蛋白进行偶联,电泳表征表明蛋白条带明显上移,多肽免疫原制备成功。将重组蛋白和多肽免疫原免疫小鼠,采用ELISA和免疫印迹研究血清识别情况和交叉反应。结果显示,重组蛋白OmpA免疫血清与副溶血弧菌(CICC 21618)效价最高等(1:121500),而对其它5株副溶血弧菌和11株弧菌属细菌效价在1:4500-1:13500,明显降低,并存在差异性。与测试的非弧菌中大肠杆菌的效价最高,达到了1:40500。免疫印迹检测结果显示,该血清可与His-OmpA蛋白、6株副溶血弧菌(CICC 21618、CICC21617、CICC 21619、CICC 10552、CICC 21528、CICC 1.1616)全菌蛋白发生特异性反应,而与其它弧菌菌株仅有轻微交叉反应,但对于无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟杆菌、大肠杆菌也存在显著的反应条带。多肽抗原免疫血清对菌体和全菌蛋白识别效果均较差。以上研究结果能够表明副溶血弧菌外膜蛋白OmpA具有较好的免疫原性和表面暴露性,但是否能够制备均一识别副溶血弧菌的单克隆抗体仍有待进一步的研究。