目的:以ApoE~(-KD025 IC50/-)小鼠和RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,以NLRP3炎症小体介导的泡沫细胞焦亡为切入点,探讨清热解毒法经典方剂四妙勇安汤通过调控mtROS/NLRP3,抑制巨噬细胞泡沫化及焦亡进而抑制动脉粥样硬化的发生发展,阐明四妙勇安汤干预AS分子机制,为临床以“毒邪论治”心血管病提供生物学依据。方法:1.将8周龄的52只ApoE~(-/-)小鼠按随机数字表法分为模型组,四妙勇安汤低、中、高剂量组,辛伐他汀组,每组10只。另10只C57BL/6J小鼠作为正常组。正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,四妙勇安汤干预组分别给予四妙勇安汤低、中、高剂量浓度(11.61g·kg~(-1)、23.14g·kg~(-1)、34.9g·kg~(-1))灌胃,辛伐他汀组给予辛伐他汀2.275mg·kg~(-1)灌胃。以上给药1次/日,0.5ml/次,正常组给予普通饲料,药物干预组给予高脂饲料喂养4周。于4周后全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG),胆固醇(TC),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量;HE染色观察主动脉脂质沉积情况;透射电镜检测线粒体超微结构变化;ELISA法检测血清ROS水平;Real time RT-PCR法和wes全自动蛋白表达技术检测主动脉焦亡因子NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD的m RNA和蛋白表达情况。2.(1)设置0、25、50、100、200μg/m L5个浓度梯度,采用CCK-8法观察不同浓度ox-LDL对RAW264.7巨噬细胞泡沫化及增殖能力的影响。(2)设置12h、24h、48h等3个时间点,5%、10%、15%等3个浓度梯度,采用CCK-8法观察不同浓度空白血清、四妙勇安汤含药血清对ox-LDL诱导的RAW264.7泡沫细胞增殖能力的影响。(3)将RAW264.7巨噬细胞分为空白对照组(Control组)、ox-LDL组、空白血清组(KB组)、四妙勇安汤含药血清组(SMYA组)。采用油红O染色观察各组巨噬细胞泡沫化情况;透射电镜观察各组细胞焦亡情况;免疫荧光法检测各组细胞GSDMD表达情况。3.(1)将RAW264.7巨噬细胞分为Control组、ox-LDL组、KB组、SMYA组。采用酶联免疫(ELISA)法检测各组细胞上清液IL-1β含量;Real time RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达情况。(2)排除空白血清作用后,引入NLRP3炎症小体抑制剂MCC950,将RAW264.7细胞分为Control组、ox-LDL组、SMYA组、ox-LDL+MCC950组、SMYA+MCC950组。采用CCK-8法检测各组细胞活力;ELISA法检测各组细胞上清液IL-1β含量;Real time RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞焦亡因子ASC、NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达情况。4.(1)将RAW264.7细胞分为Control组、ox-LDL组、KB组、SMYA组。采用透射电镜观察各组细胞线粒体超微结构;JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位;Mito SOX红色荧光探针标记mtROS,共聚焦显微镜观察荧光强度。(2)排除空白血清作用后,引入mtROS清除剂Mito-TEMPO,将细胞分为Control组、ox-LDL组、SMYA组、ox-LDL+Mito-TEMPO组、SMYA+Mito-TEMPO组。采用CCK-8法检测各组细胞活力;JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位;Mito SOX红色荧光探针标记mtROS,共聚焦显微镜观察荧光强度;ELISA法检测各组细胞上清液IL-1β含量;Real time RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达情况。结果:1.(1)全自动生化分析仪检测结果显示,与正常组相比,模型组血清TG,TC,LDL-C水平明显升高(P<0.01),HDL-C水平明显降低(P<0.01);与模型组相比,四妙勇安汤低、中、高剂量组血清TG,TC,LDL-C水平明显降低(P<0.01),HDL-C水平明显升高(P<0.01),以四妙勇安汤高剂量组效果最为显著。(2)HE染色显示主动脉脂质沉积情况,模型组主动脉斑块大量脂质沉积,泡沫细胞增多,四妙勇安汤低、中、高剂量组主动脉板块脂质沉积和泡沫细胞有不同程度的减少,以高剂量组效果最为显著。(3)透射电镜观察线粒体超微结构结果显示,正常组小鼠线粒体结构完整、呈长棒状;模型组小鼠线粒体肿胀、嵴变短变少甚至消失,部分为空泡样改变;使用四妙勇安汤处理后,与模型组相比,线粒体结构较完整,形态趋于正常。(4)ELISA结果显示与正常组相比,模型组血清ROS水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,四妙勇安汤低中高剂量组血清ROS水平明显降低(P<0.05,P<0.01),以Panobinostat分子式高剂量组效果最为显著。(5)Real time RT-PCR法和wes全自动蛋白表达技术检测结果显示,与正常组相比,模型组主动脉细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的m RNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与模型组相比,四妙勇安汤低中高剂量组NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β的m RNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。以四妙勇安汤高剂量组的效果最为显著。2.(1)不同浓度ox-LDL对RAW264.7细胞增殖能力的影响:不同浓度ox-LDL干预RAW264.7巨噬细胞24h后,25μg/m L细胞活力未见明显改变,50-200μg/m L细胞活力随着ox-LDL浓度增加而降低,其中100μg/m L细胞活力约50%,结合相关文献研究,选用100μg/m L浓度进行接下来的实验。(2)不同浓度、不同作用时间下空白血清、四妙勇安汤含药血清对ox-LDL诱导的RAW264.7泡沫细胞增殖能力的影响:各组四妙勇安汤含药血清作用24h时,细胞活力接近于1;与control组相比,ox-LDL组细胞活力明显降低(P<0.01);与ox-LDL组相比,各浓度的SMYA组细胞活力明显升高(P<0.01),当浓度为10%时细胞活力最高,15%时较10%呈现下降趋势。因此,选择10%空白血清,10%四妙勇安Functionally graded bio-composite汤含药血清作用细胞24h进行后续实验。(3)油红O染色:各组细胞呈圆形,细胞核圆形呈蓝色,胞浆中脂滴染成橘红色。control组未见脂滴,ox-LDL组和KB组胞浆泡沫化,且可见大量橘红色脂滴,四妙勇安汤组细胞泡沫化减轻,橘红色脂滴明显减少。(4)各组细胞超微结构焦亡情况:control细胞呈圆形,细胞核染色质致密,细胞质均匀分布,颜色较深,细胞无水肿,细胞膜光滑完整;ox-LDL组细胞明显肿胀变圆,微管和微丝断裂,超微结构明显被破坏,细胞核肿胀,内容物减少且分布不均,细胞质肿胀,胞浆变薄,颜色变浅,内质网和线粒体等细胞器明显减少和肿胀,细胞膜被破坏,膜上形成大量小孔,细胞膜明显破裂,细胞内容物流出;KB组与ox-LDL组呈现相同的表现;SMYA组细胞膜破坏减少,细胞膜较完整。(3)细胞焦亡标志性蛋白GSDMD的荧光表达:细胞核为蓝色,GSDMD表达位于细胞核和细胞质,呈绿色。与control组相比,ox-LDL组、KB组GSDMD荧光强度明显升高,二者无明显差异;与ox-LDL组相比,SMYA组GSDMD荧光表达量明显降低。3.(1)各组细胞上清液IL-1β含量:与control组比较,ox-LDL组、KB组细胞上清液IL-1β含量明显升高(P<0.01),且二者相比无明显差异;与ox-LDL组比较,SMYA组细胞上清液IL-1β含量明显降低(P<0.01)。各组细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达情况:与control组比较,ox-LDL组、KB组细胞NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达量明显升高(P<0.01),且二者相比无明显差异;与ox-LDL组比较,SMYA组细胞NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01)。(2)由于ox-LDL组和KB组IL-1β含量、焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达无明显差异,因此可以排除空白血清的影响,引入NLRP3炎症小体抑制剂MCC950,MCC950可明显提高细胞增殖能力(P<0.01);与control组比较,ox-LDL组细胞上清液IL-1β含量明显升高(P<0.01),泡沫细胞内ASC、NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达量明显升高(P<0.01);与ox-LDL组比较,SMYA组、ox-LDL+MCC950组细胞上清液IL-1β含量明显降低(P<0.01),泡沫细胞内ASC、NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01);与SMYA组比较,SMYA+MCC950组细胞上清液IL-1β含量明显降低(P<0.05),泡沫细胞内ASC、NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05,P<0.01)。4.(1)透射电镜结果显示:control组线粒体结构完整、呈长棒状;ox-LDL组、KB组线粒体肿胀、嵴变短变少甚至消失,且二者无明显差异;SMYA组线粒体结构完整,结构恢复长棒状,线粒体数量变多。JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位:结果显示control组红色荧光较强,线粒体膜电位较高;ox-LDL组、KB组红色荧光较弱,绿色荧光较强,线粒体膜电位最低,且二者无明显差异;SMYA组红色荧光增强,绿色荧光减弱,线粒体膜电位升高。共聚焦显微镜观察mtROS荧光强度:结果显示control组Mito SOX荧光探针几乎无红色荧光;ox-LDL组、KB组Mito SOX荧光探针红色荧光最强,且二者无明显差异;SMYA组Mito SOX荧光探针红色荧光减弱。(2)由于ox-LDL组和KB组透射电镜观察、线粒体膜电位、mtROS荧光含量二组结果无明显差异,因此排除空白血清的影响,引入mtROS清除剂Mito-TEMPO,Mito-TEMPO可显著提高泡沫细胞增殖能力(P<0.05,P<0.01)。JC-1法检测各组细胞线粒体膜电位:结果显示与control组比较,ox-LDL组线粒体膜电位较低;与ox-LDL组比较,SMYA组、ox-LDL+Mito-TEMPO组线粒体膜电位升高;与SMYA组比较,SMYA+Mito-TEMPO组线粒体膜电位升高。共聚焦显微镜观察mtROS荧光强度:结果显示与control组比较,ox-LDL组细胞Mito SOX荧光探针红色荧光较强;与ox-LDL组相比,SMYA组、ox-LDL+Mito-TEMPO组细胞Mito SOX荧光探针红色荧光减弱;与SMYA组比较,SMYA+Mito-TEMPO组Mito SOX荧光探针红色荧光减弱。与control组比较,ox-LDL组细胞上清液IL-1β水平升高(P<0.01),泡沫细胞内焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白水平升高(P<0.01);与ox-LDL组相比,SMYA组、ox-LDL+Mito-TEMPO组细胞上清液IL-1β水平降低(P<0.01),泡沫细胞内焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白水平降低(P<0.01);与SMYA组相比,SMYA+Mito-TEMPO组细胞上清液IL-1β水平降低(P<0.05),泡沫细胞内焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD的m RNA和蛋白水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论:1.四妙勇安汤具有调节血脂,减轻主动脉斑块脂质沉积,改善线粒体结构的作用。2.四妙勇安汤通过抑制巨噬细胞泡沫化及泡沫细胞焦亡发挥抗动脉粥样硬化作用。3.四妙勇安汤抑制巨噬细胞泡沫化及泡沫细胞焦亡发挥抗动脉粥样硬化作用是通过提高线粒体膜电位、抑制mtROS生成进而调控NLRP3/caspase-1实现的,可能是该方防治AS的新机制。