研究目的:肌萎缩会增加跌倒风险,延长疾病康复期,以及导致肌肉功能进一步下降,形成恶性循环,已成为当前健康医学领域亟待解决的问题。运动作为一种安全、低副作用的干预策略,对于预防和治疗肌萎缩具有重要意义。然而,其作用机制尚存在许多未知之处,有待进一步研究。我们的前期研究首次发现去糖酶DJ-1在运动及肌萎缩中具有重要作用,但且具体机制尚未得到充分阐述。因此,本研究旨在:(1)利用公共数据库和动物模型探讨肌萎缩及抗阻训练对骨骼肌DJ-1表达水平的影响;(2)构建骨骼肌特异性敲除DJ-1转基因小鼠,明确DJ-1在运动能力及肌萎缩调控中的作用,并阐明其潜在的分子机制;(3)验证抗阻训练是否通过骨骼肌DJ-1发挥改善肌萎缩的作用;(4)应用DJ-1抑制剂-Compound23,模拟其在体内骨骼肌萎缩发挥的作用。本研究将有助于深化对肌肉萎缩治疗的认识,为开发新的干预策略提供理论依据。研究方法:本文共分为五部分。研究一,通过多组学分析及动物模型探讨肌萎缩及抗阻训练对去糖酶DJ-1表达水平的影响。多组学分析方面,利用“muscles”为关键词在Pub Med、GEO Data Sets等数据库检索肌萎缩相关转录组、蛋白质组、单细胞测序数据库,采用R软件对健康组与肌萎缩组的DJ-1差异表达进行分析。动物实验方面,分别建立废用性肌萎缩小鼠模型及抗阻训练小鼠模型以检测骨骼肌DJ-1的表达水平。废用性肌萎缩小鼠模型中,将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组(WT组,n=5)和后肢悬吊组(WT+Immo组,n=5)。后肢悬吊方案如下:使用医用胶带缠住小鼠尾部并悬吊于笼架顶部14天,期间保持小鼠后肢悬空但前肢着地,可进行较大范围活动。悬吊结束后,立即收集腓肠肌等组织样本,并通过q RT-PCR和Western blot检测腓肠肌中DJ-1表达水平。抗阻训练小鼠模型中将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为安静组(CON组,n=5)和抗阻训练组(RE组,n=5)。抗阻训练小鼠每天进行10个重复抗阻训练,每个重复训练间隔休息2min。第1-2个重复,抗阻训练的强度为最大负重能力的50%,第3-4个重复,抗阻训练的强度为最大负重能力的75%,第5-10个重复,抗阻训练的强度为最大负重能力的100%。小鼠每周训练6天,共训练12周,每2周进行小鼠最大负重能力测试,并调整抗阻训练的强度。训练结束后,立即收集腓肠肌等组织样本,并通过q RT-PCR和Western blot检测腓肠肌中DJ-1表达水平。研究二,构建骨骼肌特异性敲除DJ-1转基因小鼠,明确骨骼肌DJ-1在运动能力及肌萎缩的调控作用。DJ-1-flox小鼠与Myl1-cre工具鼠交配,通过CreLox P系统获得骨骼肌特异性敲除DJ-1(muscle specific knockout DJ-1,MDKO)小鼠,给予普通饮食喂养,待小鼠长至10-12周龄后进行抓握力、最大负重能力、运动耐力等测试;检测小鼠体成分,收取腓肠肌等组织样本进行形态学检测(H&E染色、肌纤维分型荧光染色、电镜),腓肠肌能量代谢分析(OROBOROS O2K),快肌纤维、慢肌纤维、线粒体数量、线粒体复合物相关基因表达水平检测(q RT-PCR),DJ-1、线粒体复合物等相关蛋白表达水平分析(Western blot)。研究三,结合在体动物实验及体外细胞实验阐明骨骼肌DJ-1调控运动能力及肌萎缩的分子机制。动物实验中,建立后肢悬吊肌萎缩动物模型,模型构建方案同第一部分。建模成功后,收取腓肠肌组织进行LEE011化学结构转录组测序、形态学检测(H&E染色、肌纤维分型荧光染色、ROS活性氧染色),腓肠肌能量代谢(OROBOROS O2K),快肌纤维、慢肌纤维、萎缩、线粒体复合物相关基因表达水平检测(q RT-PCR),自噬通路、肌肉发育通路、肌肉萎缩、泛素化修饰等相关蛋白表达水平分析(Western blot),提取腓肠肌细胞浆蛋白及核蛋白检测Fox O1表达水平。细胞实验中,培养C2C12成肌细胞,待其分化为肌管细胞后进行sh-DJ-1慢病毒感染实验,48小时后检测肌肉发育及萎缩相关蛋白表达水平(Western blot);培养HEK 293T细胞分别转染human Trim63 promoter、human Fbxo32 promoter等质粒并进行双荧光素酶实验。研究四,验证抗阻训练是否通过骨骼肌DJ-1发挥改善肌萎缩的作用。分别对10周龄雄性对照小鼠及MDKO小鼠建立后肢悬吊肌萎缩模型。建模成功后进行为期4周的抗阻训练干预,具体方案同第一部分。最后一次训练后立即取材并收取腓肠肌组织,通过q RT-PCR及Western blot检测肌萎缩相关基因、蛋白表达水平。研究五,应用DJ-1抑制剂-Compound23模拟DJ-1在体内骨骼肌的作用。对10周龄雄性对照小鼠及MDKO小鼠进行后肢悬吊,悬吊7天后进行腓肠肌原位注射Compound23,悬吊14天后取材、收集腓肠肌组织等组织,通过H&E染色、q RT-PCR及Western blot评估Compound23在体内骨骼肌的作用。实验结果:研究一,转录组测序结果显示,后肢悬吊显著下调小鼠骨骼肌Dj-1基因表达水平(p<0.05),进一步验证小鼠骨骼肌样本后,发现后肢悬吊降低骨骼肌DJ-1蛋白与基因水平(p<0.01)。通过对临床肌肉样本进行转录组测序分析,发现脚踝损伤病人肌肉组织Dj-1基因表达水平与恢复活动时间呈正相关(p<0.01)。此外,12周的抗阻训练能够促进小鼠腓肠肌组织DJ-1表达(p<0.01)。研究二,骨骼肌敲除DJ-1不影响小鼠体重,但导致瘦体重减少(p<0.05)、肌肉重量降低(p<0.05)和脂肪重量增加(p<0.05)。运动能力测试表明,骨骼肌敲除DJ-1削弱了小鼠抓握力(p<0.001)、最大负重能力(p<0.01)、悬吊能力(p<0.01)、抗疲劳能力(p<0.01)及运动耐力(p<0.01)。进一步的形态学观察发现,骨骼肌敲除DJ-1降低了腓肠肌细胞(p<0.01)横截面积,导致腓肠肌线粒体嵴断裂、肿胀和呼吸代谢功能下降(p<0.05)。q RT-PCR和Western blot结果显示,骨骼肌敲除DJ-1下调部分I型肌纤维和IIA型肌纤维相关基因表达水平,但对骨骼肌纤维类型、线粒体数量和线粒体复合物相关基因及蛋白表达无显著影响。研究三,在后肢悬吊条件下ABT-263研究购买,骨骼肌敲除DJ-1加剧瘦体重及肌肉重量的流失(p<0.01);促进腓肠肌细胞核内移(p<0.01),减小肌细胞横截面积(p<0.05);此外,显著下调I型肌纤维、IIA型肌纤维标志物基因表达水平;损伤腓肠肌线粒Biological kinetics体能量代谢功能,降低线粒体数量(p<0.01)、下调线粒体复合物基因(p<0.05)及蛋白的表达水平,但不改变肌纤维类型,不影响骨骼肌氧化应激水平。进一步的转录组测序及Western blot、q RT-PCR检测发现,骨骼肌敲除DJ-1上调受Fox O通路调控肌萎缩基因Trim63(p<0.001)、Fbxo32(p<0.05)、Mstn(p<0.01)表达水平,增加肌肉蛋白泛素化水平,但对肌卫星细胞标志物基因和肌肉发育相关蛋白表达无影响,且不影响自噬通路相关分子表达。双荧光素酶报告实验验证骨骼肌DJ-1通过Trim63上Fox O1-195/-189结合位点、Fbxo32 promoter上Fox O1-38/-31结合位点转录调控肌萎缩的发生发展。第四部分,通过Western blot和q RT-PCR检测运动干预前后悬吊条件下对照小鼠及MDKO小鼠萎缩基因及蛋白表达水平,结果显示,骨骼肌DJ-1的缺失削弱了抗阻训练对肌萎缩的改善作用,骨骼肌DJ-1在抗阻训练中对肌萎缩的改善发挥重要作用。第五部分,在悬吊条件下,腓肠肌注射Compound23减小肌细胞横截面积(p<0.05)。骨骼肌敲除DJ-1部分抵消悬吊刺激下Compound23对肌萎缩的影响(p<0.05)。研究结论1.骨骼肌DJ-1表达水平与肌萎缩呈负相关,而运动可促进DJ-1表达。骨骼肌缺失DJ-1的小鼠运动能力受损,并伴随肌萎缩发生。2.DJ-1在运动能力及肌萎缩中的作用,与AKT-Fox O1-Mur F1信号通路相关。骨骼肌缺失DJ-1抑制AKT-Fox O1磷酸化水平,促进Fox O1进入细胞核并最终在转录水平激活Trim63、Fbxo32等萎缩基因表达。3.抗阻训练改善肌萎缩的作用,部分与其促进骨骼肌DJ-1表达相关。