创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是平战时青壮年死亡与伤残的重要原因,其发生率日益增加,目前已成为一个不可忽视的公共卫生问题。在中型至重型TBI患者中,约有三分之一的患者存在着阵发性交感神经兴奋(Paroxysmal sympathetic hyperactivity,PSH),主selleckchem MRTX1133要表现为运动僵直、发热、心动过速、出汗和高血压等,可导致颅内外器官功能障碍,给TBI患者的治疗带来巨大挑战。TBI后机体交感神经兴奋性与脑损伤程度关系密切,合并PSH的患者死残率要明显高于交感活性轻度升高的患者。一般而言,交感神经兴奋在维持机体正常生理功能外,也可在病理条件下对内环境的稳态产生负面影响。交感神经兴奋是机体各系统功能障碍(包括心肌坏死、代谢异常、内分泌障碍和免疫抑制等)的重要原因。在中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,交感神经兴奋也可能导致脑组织血流量增加、颅内压失常,增加血脑屏障的通透性,加重脑缺血、脑水肿与坏死。然而,目前TBI合并PSH的相关研究较为缺乏,当下的研究往往将研究重点放在TBI合并PSH的危险因素、发病机制和治疗手段等方面,未能探索其对TBI后神经功能损害的具体机制,这也导致TBI合并PSH的相关治疗手段缺乏特异性,成效甚微。因此,如能明确TBI合并PSH造成神经功能损害的具体机制,并依此开发全新的治疗靶点,将为未来降低TBI的死残率奠定充分的理论基础。第一部分:TBI合并PSH患者血清中Ang Ⅱ的升高与神经功能损害存在相关性研究目的:(1)筛选TBI合并PSH患者与普通TBI患者血清中各类细胞因子表达的差异;(2)分析TBI患者血清中血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)浓度与神经功能的损害间的关系。研究方法:(1)收集TBI合并PSH患者与普通TBI患者的血清,采用细胞因子阵列芯片对血清中细胞因子的含量进行检测;(2)对细胞因子阵列芯片的检测结果进行生物信息学分析,以探寻差异细胞因子和相关通路;(3)采用ELISA法,检测58名TBI患者血清中severe bacterial infectionsAng Ⅱ的浓度并记录;(4)6个月后,随访58名患者的神经功能预后,并分析血清Ang Ⅱ浓度与TBI神经功能预后间的临床相关性。研究结果:(1)细胞因子阵列芯片显示,与普通TBI患者相比,TBI合并PSH患者血清中共差异表达87个细胞因子,其中Ang Ⅱ、Ang-like Factor和ACE的改变具有明显差异;(2)通路富集分析显示,差异性表达的细胞因子主要富集于肾素血管紧张素系统;(3)Mann-Whitney U检验提示,不良预后组血清Ang Ⅱ浓度高于良好预后组,差异具有统计学意义;(4)TBI患者6个月GOS评分与血清Ang Ⅱ浓度存在线性相关性,血清Ang Ⅱ浓度对TBI患者神经功能预后预测的敏感性为75.61%,特异度为70.59%,约登指数为0.462,曲线下面积(Area under curve,AUC)为0.716。研究结论:(1)TBI合并PSH患者血清中Ang Ⅱ的差异性表达较为明显;(2)TBI患者中,不良预后组血清Ang Ⅱ浓度明显高于良好预后组;(3)TBI患者6个月GOS评分与血清Ang Ⅱ浓度存在临床相关性,血清Ang Ⅱ浓度可能在预测TBI患者神经功能预后方面存在一定的价值。第二部分:Ang Ⅱ-AT1R轴影响TBI后神经功能预后的作用机制筛选研究目的:(1)探究AT1R在TBI后损伤组织处随时间和空间的表达情况;(2)筛选Ang Ⅱ-AT1R轴影响TBI后神经功能预后的相关机制。研究方法:(1)建立C57小鼠控制性皮层损伤(Controlled cortical impact,CCI)模型,于损伤后的1,3,7,14,28天取损伤处脑组织,通过RT-q PCR和WB检测手段,明确AT1R在TBI后损伤组织处随时间的表达情况;(2)于伤后第7天取损伤处脑组织进行切片,利用免疫荧光双染,确定AT1R在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和血管内皮细胞间的空间分布情况;(3)构建Agtr1a基因敲除小鼠后进行TBI造模,通过转录组测序分析其与WT小鼠在TBI后基因表达的差异;(4)对转录组测序的结果进行生物信息学分析,以探寻差异通路与机制。研究结果:(1)所建立的CCI模型稳定,效果较好;(2)小鼠TBI后脑内AT1的表达随时间进展而升高,在TBI后第7天到达高峰,持续至28天;(3)免疫荧光染色提示AT1R在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞中表达较为丰富,在少突胶质细胞表达相对较少;(4)成功构建Agtr1a基因敲除小鼠,其体内AT1R的表达微弱;(5)转录组测序显示,与Agtr1a-KO组相比,WT组在CCI损伤后出现448个差异表达的基因,其中,上调的基因154个,下调Talazoparib供应商的基因294个;(6)生物信息学分析结果表明,差异表达的基因可能与星形胶质细胞的激活等通路相关。研究结论:(1)AT1R的表达在TBI后随时间增加;(2)AT1R在TBI后的空间分布广泛,在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞等细胞中均有表达;(3)AT1R-KO小鼠与WT小鼠在TBI后的基因表达存在差异,AT1R的缺乏可能与星形胶质细胞的激活、细胞表面受体信号转导、补体和钙信号通路激活等过程有关。第三部分:Ang Ⅱ-AT1R轴通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路介导星形胶质细胞的极化研究目的:(1)筛选Ang Ⅱ干预后星形胶质细胞内基因表达的变化;(2)揭示Ang Ⅱ-AT1R轴在星形胶质细胞极化中的相关作用;(3)分析Ang Ⅱ-AT1R轴通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路对星形胶质细胞极化产生的影响。研究方法:(1)提取原代星形胶质细胞,通过Ang Ⅱ干预后进行转录组测序,分析基因表达差异;(2)通过生物信息学分析,探究Ang Ⅱ干预后星形胶质细胞差异表达基因所富集的通路与信号转导机制;(3)采用RT-q PCR,WB检测和免疫荧光双染等方法,明确Ang Ⅱ干预对于星形胶质细胞极化的相关作用;(4)利用IP3R抑制剂、钙离子螯合剂和NLRP3抑制剂等,探究Ang Ⅱ-AT1R轴通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路对星形胶质细胞极化产生的影响;(5)利用立体定向注射、WB检测、RT-q PCR和免疫荧光双染法,在体研究Ang Ⅱ-AT1R轴通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路对星形胶质细胞极化产生的影响。研究结果:(1)原代培养的星形胶质细胞纯度较高;(2)Ang Ⅱ干预后,共筛选出差异表达的基因184个,其中,Ang Ⅱ组与对照组相比,干预上调的基因126个,下调的基因58个;(3)根据生物信息学分析结果,差异表达基因的富集通路包括钙信号通路和补体和凝血级联信号通路等;(4)与对照组相比,Ang Ⅱ干预可增加星形胶质细胞C3的表达,而对S100A10的表达无明显影响;(5)Ang Ⅱ-AT1R轴可增加星形胶质细胞内IP3R的表达和Ca~(2+)信号上调;(6)Ang Ⅱ-AT1R轴可通过IP3R/Ca~(2+)影响星形胶质细胞炎性小体NLRP3和ASC的表达;(7)Ang Ⅱ-AT1R轴可通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路促进星形胶质细胞向A1型极化;(8)体内实验表明,Ang Ⅱ-AT1R轴可在体内通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3通路参与TBI后星形胶质细胞向A1型极化。研究结论:(1)Ang Ⅱ干预后星形胶质细胞内存在大量差异基因表达,这类基因主要集中于钙信号通路和补体C3等通路;(2)Ang Ⅱ可促进星形胶质细胞向A1型极化;(3)Ang Ⅱ-AT1R轴可通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3介导星形胶质细胞的A1型极化;(4)体内实验进一步证实了Ang Ⅱ-AT1R轴可通过IP3R/Ca~(2+)/NLRP3影响TBI后的星形胶质细胞A1型极化。第四部分:Ang Ⅱ-AT1R轴通过调节星形胶质细胞A1型极化影响TBI后的神经功能预后研究目的:(1)明确星形胶质细胞A1型极化与TBI后神经功能损害的关系;(2)探究Ang Ⅱ-AT1R轴通过调节星形胶质细胞极化影响TBI后神经功能预后的相关机制。研究方法:(1)采用星形胶质细胞条件培养基(Astrocyte conditioned medium,ACM)对原代神经元进行干预,对神经元进行轴突长度分析;(2)通过流式细胞检测术,分析Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化ACM对于原代神经元凋亡的作用;(3)采用细胞活力检测,分析Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化ACM对于原代神经元细胞活力的作用;(4)通过WB检测,分析Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化对于TBI后小鼠脑组织血脑屏障完整性以及细胞凋亡的影响;(5)通过脑含水量检测,分析Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化对于TBI后小鼠脑组织水肿的影响;(6)通过透射电镜观察Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化对于TBI后小鼠脑组织超微结构改变的影响;(7)利用神经行为学分析,探究Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1极化在TBI伤后第1,3,7,14,28天对小鼠神经功能恢复的影响。研究结果:(1)ACM(-)和ACM(Control)之间的轴突生长无明显差异,ACM(Ang Ⅱ)处理可明显降低轴突长度,而ACM(Ang Ⅱ+KD)和ACM(Ang Ⅱ+Semaglutide)可逆转ACM(Ang Ⅱ)导致的轴突生长抑制作用;(2)Ang Ⅱ处理后的ACM可使神经元凋亡率升高至23.5%,而AT1R-KD和semaglutide可以减弱该种凋亡作用;(3)Ang Ⅱ-AT1R轴通过调节星形胶质细胞A1型极化也可降低神经元的细胞活性;(4)在损伤组织的周围,血脑屏障紧密连接相关蛋白Claudin-5和ZO-1在TBI后表达减少,而AT1R-KO和semaglutide可有效提升TBI后Claudin-5和ZO-1的表达;(5)TBI后脑组织含水量增加,而AT1R-KO和semaglutide可有效减少脑组织含水量;(6)TBI后可见caspase-3,BAX表达的增高和BCL-2表达含量的减少,而AT1R-KO和semaglutide可减少TBI损伤部位细胞凋亡调控蛋白的表达,增加凋亡抑制蛋白BCL-2的表达;(7)TBI后神经元内可出现空泡,线粒体超微结构存在改变,以肿胀为主,而TBI+KO组和TBI+Semaglutide组中,神经元超微结构改变较轻;(8)阻断Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1型极化可有效降低TBI后小鼠的m NSS评分;(9)在TBI损伤后,TBI+KO组和TBI+Semaglutide组小鼠转棒时间显著高于TBI组。研究结论:(1)Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1型极化条件培养基可抑制神经元的轴突生长;(2)Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1型极化可降低原代神经元的活力,并促进其凋亡;(3)Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1型极化可对TBI后血脑屏障的完整性产生影响,并在TBI后的脑水肿过程中发挥重要作用;(4)Ang Ⅱ-AT1R轴介导的星形胶质细胞A1型极化可能参与TBI后小鼠的神经功能损害过程,抑制此A1型极化有助于TBI后的神经功能恢复。