目的:胃“炎-癌”转化是胃癌发生的早期事件,中医根据对胃“炎-癌”病因病机的认识采用固本培元法进行治疗,临床疗效颇佳,但作用机制仍不完全明确。LASP1是近年发现与肿瘤侵袭和转移相关的蛋白,可作为抗肿瘤药物干预的靶点,值得进一步研究其与胃“炎-癌”转化发生进展的相关性。因此,本研究采用胃“炎-癌”转化不同病理阶段的胃黏膜样本研究LASP1/N-WASP/ARP3通路是否参与胃“炎-癌”转化过程,采用N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)联合隔日禁食法诱导C57BL/6J小鼠复制胃“炎-癌”转化关键节点——胃癌前病变(GPL)的小鼠模型,研究固本培元法代表方理中消痞方干预作用。在此基础上,以理中消痞方含药血清干预胃癌细胞,研究理中消痞方对胃癌细胞生长、形态、LASP1/NWASP/ARP3通路、上皮-间质转化(EMT)关键分子及细胞凋亡的影响,从而揭示理中消痞方阻断胃“炎-癌”转化的作用机制,丰富临床应用固本培元法治疗胃“炎-癌”转化的药效机制研究。方法:1.收集胃“炎-癌”转化不同病理阶段的临床胃黏膜标本,利用免疫组织化学法观察LASP1/N-WASP/ARP3通路和EMT相关蛋白在胃黏膜标本中的表达情况。2.采用SD大鼠进行理中消痞方急性毒性实验,24 h内3次给药,检测大鼠体重变化,观察外观、行为和精神等一般情况,实验结束后解剖,以体重、器官体积和性质等为标准,评估理中消痞方的安全性;采用雄性C57BL/6J小鼠,予以MNU120μg/m L自由饮用配合隔日禁食法复制GPL小鼠模型。造模第10周起,分别予以理中消痞方高、中和低剂量灌胃干预10周。实验结束后取胃黏膜组织、取血分离血清;利用HE、AB-PAS染色观察病理学改变;透射电镜下观察细胞超微结构;检测血清和胃黏膜炎症因子变化;检测胃黏膜GPL分子标志物、LASP1/NWASP/ARP3通路、EMT等关键基因和蛋白。3.采用人胃癌细胞MKN45细胞,予以不同体积分数的理中消痞方含药血清进行干预,检测细胞增殖、迁移侵袭能力、LASP1/NFecal microbiome-WASP/ARP3通路、EMT及细胞凋亡等关键基因和蛋白。结果:1.LASP1/N-WASP/ARP3通路与胃“炎-癌”转化发生进展的相关性研究免疫组化结果显示,LASP1、N-WASP、ARP2和β-catenin在慢性浅表性胃炎中呈弱阳性表达,ARP3和Vimentin呈阳性表达。随着胃黏膜恶性进展,上述指标在各组织中的表达面积和强度逐渐增加,与胃黏膜病变严重程度呈正相关。2.理中消痞方改善GPL小鼠胃黏膜病理的研究(1)急性毒性实验24h内予以SD大鼠理中消痞颗粒136.4 g生药/kg(临床拟用剂量的81.2倍)3次灌胃给药,14天内大鼠未出现死亡,一般情况无异常,解剖重要脏器亦未见病理学异常改变。两组体重差异无统计学意义(P>0.05)。(2)药效研究(1)一般情况及脏器指数实验期间,空白组小鼠生长状况良好,灵活喜动,饮食正常,未见异常分泌物及排泄物;随着造模时间推移,模型组小鼠可见精神萎靡,皮毛无光泽伴轻度脱毛,较空白组小鼠生长发育延迟,体重减轻,大便时溏。与模型组对比,中药组小鼠精神状态、皮毛光泽度与饮食二便等均有所改善,自主活动增多。脏器指数统计结果显示,各组间肾脏、胸腺、肝脏和脾脏指数差异无统计学意义(P>0.05)。(2)病理组织形态学改变情况HE、AB-PAS染色结果显示,GPL小鼠出现胃黏膜皱襞走向不规律,固有腺体明显萎缩,甚则贯穿胃黏膜全层。上皮细胞异型性显著,细胞极性减弱或消失,细胞间炎性浸润,肠上皮化生病灶腺腔蓝染区明显。经理中消痞方治疗后,小鼠胃黏膜萎缩程度减轻,腺体selleckchem Dorsomorphin增多、排列相对整齐,细胞极性趋于恢复,蓝染病灶范围变小、染色渐浅,其中以理中消痞方高剂量组的蓝染区面积和程度最小。(3)GPL分子标志物基因水平变化实时荧光定量PCR结果显示,与空白组比较,模型组CDX2、MUC2和TFF3 m RNA表达水平升高(P<0.01)。理中消痞方可显著抑制CDX2、MUC2和TFF3基因表达(P<0.01)。(4)胃黏膜细胞超微结构变化透射电镜结果显示,GPL小鼠主细胞空泡样改变,内质网扩张肿胀、排列紊乱,细胞核核孔增多;壁细胞胃酸分泌小管扩张,部分线粒体内嵴线横纹模糊或消失,细胞核膜曲折;微血管壁薄,内壁不光滑,有赘生物黏附血管内表面,血管内皮细胞异型改变突向管腔。理中消痞方和维酶素可改善胃黏膜细胞超微结构。(5)炎症因子改变ELISA结果显示,与空白组相比,模型组小鼠血清IL-4表达水平显著降低(P<0.01),IL-6、IL-1β明显升高(P<0.01)。理中消痞方可显著抑制GPL小鼠IL-6、IL-1β的异常表达(P<0.01),但对IL-4的影响无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量PCR显示,与空白组相比,模型组小鼠胃黏膜组织TNF-α、IL-1β和IL-33 m RNA水平升高(P<0.01),理中消痞方可抑制上述胃黏膜组织炎症因子的表达(P<0.01)。(6)LASP1/N-WASP/ARP3通路相关蛋白表达的改变Western blot、免疫荧光染色结果显示,与空白组比较,模型组N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、MMP7和MMP9等EMT相关蛋白表达水平升高(P<0.01),LASP1、N-WASP、ARP2、ARP3蛋白表达水平升高(Dolutegravir使用方法P<0.01),Wnt2、β-catenin、p-β-catenin、TGF-β1和TGFβ2表达水平升高(P<0.01),理中消痞方和维酶素可抑制上述蛋白表达(P<0.01)。与空白组相比,GPL小鼠胃黏膜E-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组相比,理中消痞方和维酶素可上调E-cadherin蛋白表达(P<0.01)。3.理中消痞方对MKN45细胞恶性生物行为学的影响(1)对胃癌细胞形态及增殖能力的影响CCK-8法和Ed U实验结果显示,理中消痞方含药血清可抑制MKN45细胞增殖,且呈时间剂量依赖性(P<0.01,P<0.05)。显微镜下观察细胞形态变化,与对照组相比,2%体积分数理中消痞方含药血清干预后,MKN45细胞呈长梭形改变,伪足增多、细胞内颗粒物增加;2.5%体积分数理中消痞方含药血清干预后,MKN45细胞皱缩、变圆,细胞边缘粗糙甚则破裂。(2)对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响划痕实验结果显示,理中消痞方含药血清可抑制MKN45细胞迁移,且呈时间剂量依赖性(P<0.01)。Western Blot实验结果显示,理中消痞方含药血清可上调E-cadherin,降低N-cadherin、Vimentin和Snail等EMT关键蛋白的表达抑制细胞侵袭(P<0.01,P<0.05)。(3)对胃癌细胞LASP1/N-WASP/ARP3关键蛋白和基因水平的影响实时荧光定量PCR、Western blot和DCFH-DA结果提示,理中消痞方含药血清干预后,LASP1、N-WASP、ARP2、ARP3 m RNA与蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05);理中消痞方可通过降低Bcl-2/Bax比值、下调C-myc和上调ROS水平促进细胞凋亡(P<0.01,P<0.05)。结论:1.LASP1/N-WASP/ARP3通路参与胃“炎-癌”转化过程,并与胃黏膜病变严重程度呈正相关。2.理中消痞方最大给药安全剂量为136.4 g生药/kg,即临床人拟用剂量的81.2倍,临床用药剂量安全可靠;理中消痞方可抑制LASP1/N-WASP/ARP3通路阻断胃“炎-癌”转化进程,改善GPL小鼠胃黏膜萎缩、肠上皮化生及异型增生,修复受损胃黏膜。3.理中消痞方可改变MKN45细胞恶性生物行为学,抑制LASP1/N-WASP/ARP3信号通路、上皮-间质转化、诱导胃癌细胞凋亡,进而阻断胃黏膜恶性进展。