目的:收集人体冠状动脉检测DEL-1基因的表达变化,并建立Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化模型沉默CXCR4,探讨沉默前后GSK-3β/CEBP-β与DEL-1的关系;进一步建立泡沫细胞模型沉默DEL-1,探究DEL-1与GSK-3β/CEBP-β的关系,从而探讨DEL-1参与动脉粥样硬化的机制。方法:(1)探讨DEL-1表达与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性之间的关系选取人体冠状动脉标本共60例,其中有20例明确诊断为冠状动脉粥样硬化性心脏病猝死记为冠心病猝死组(SCD组);有21例诊断冠心病但死因非冠心病猝死的记为冠心病组(CHD组);同期间内未患动脉粥样硬化19例记为对照组(CON组)。对冠脉组织进行HE染色检测其病理学改变,并测量冠脉管腔狭窄程度、内膜厚度、斑块面积等评估血管结构改变;采用免疫组织化学及西方印迹检测冠脉DEL-1、MIP-1α、TNF-α、MIP-2蛋白的定位与表达;用Pearson相关系数法分析病变组DEL-1蛋白表达与上述结构相关指标、DEL-1蛋白表达与上述炎性因子间的关系。(2)建立动物模型探讨DEL-1参与动脉粥样硬化的可能机理将32只6-7周龄SPF级Apo E~-/~-小鼠随机分为CON组、AS组、AAV9-e GFP组、AAV9-CXCR4组。对照组采用普通饲料喂养,其余3采用高脂饲料喂养,后3组在第12周时分别用生理盐水、AAV9-control(e GFP)、AAV9-CXCR4-RNAi腺相关病毒通过尾静脉注射。用油红O染色法对小鼠主动脉大体及冰冻切片进行染色检测小鼠内膜脂质沉积的情况;通过HE染色检测小鼠斑块形成面积、管腔狭窄程度等结构改变;Movat染色检测斑块内泡沫细胞的数量;免疫组织化学染色及Western Blot检测CXCR4基因敲低的效率、CXCR4敲低后DEL-1抑制效率、GSK-3β/CEBP-β通路相关因子(GSK-3β、CEBP-β、p-GSK-3β、p-CEBP-β)、DEL-1下游炎性因子TNF-α、MIP-1α、MIP-2的蛋白表达变化;免疫荧光法检测DEL-1与CD68的共定位情况。(3)建立细胞模型探讨DEL-1与GSK-3β/CEBP-β的关系及其参与动脉粥样硬化的可能机制PMA诱导THP-1细胞为贴壁的巨噬细胞;氧化低密度脂蛋白诱导为泡沫细胞;Si-RNA转染靶向敲低DEL-1的表达;油红O染色鉴定泡沫细胞模型的建立及检测泡沫细胞内脂质沉积的情况;Western Blot及RT-PCR检测DEL-1的敲低效率、GSK-3β/CEBP-β通路相关因子(GSK-3β、CEBP-β、p-GSK-3β、p-CEBP-β)的蛋白表达水平及TNF-α、MIP-1α、MIP-2的蛋白及m RNA表达变化;免疫荧光检测DEL-1在泡沫细胞内的表达情况。结果:(1)DEL-1表达上调,冠状动脉粥样硬化斑块稳定性变差与CON组相比,CHD、SCD组内膜厚度及管腔狭窄程度均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);SCD组内膜厚度及管腔狭窄程度与CHD相比均增加,差异有统计学意义(P<0.05);IHC及WB结果发现,DEL-1、TNF-α、MIP-1α、MIP-2聚集性表达于泡沫细胞胞质中,呈棕黄色、团块状或弥散颗粒样;分别对各组间光密度值及灰度值进行统计,结果发现,CHD、SCD组的DEL-1表达均高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),SCD组光密度值及灰度值高于CHD组,差异有统计学意义(P<0.05);DEL-1在病灶中表达水平与冠状动脉内膜厚度、管腔狭窄程度、TNF-α、MIP-1α、MIP-2的表达水平之间具有正相关关系。(2)DEL-1参与动脉粥样硬化的可能机理HE、油红O、Movat染色结果显示:CON组主动脉血管形态正常,内皮细胞层连续,没有内皮下脂质沉积,平滑肌细胞排列紧密;AS、AAV9-e GFP组与CON组比较,内皮下脂质沉积明显沉积,内膜增生,血管壁不规则增厚,管腔狭窄。斑块中可见大量针状胆固醇晶体及不确定的坏死解体产物,泡沫细胞和淋巴细胞浸润于斑块边缘和底部,差异有统计学意义(P<0.05);AS组与AAV9-e GFP组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);与AS组和AAV9-e GFP组相比,AAV9-CXCR4组斑块面积、管腔狭窄3-MA MW、斑块内泡沫细胞数量略有减少,差异有统计学意义(P<0.05),AS组与AAV9-e GFP组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot结果显示:AAV9-e GFP组与AS组CXCR4表达差异无统计学意义(P>0.05),而AAV9-CXCR4组CXCR4表达显著低于AAV9-e GFP组或AS组,说明AAV9-Control(e GFP)对动脉粥样硬化的影响程度不影响研究结果,且进行尾静脉注射AAV9-si RNA-CXCR4后成功沉默CXCR4表达。IHC及WB结果发现:与CON组相比较,DEL-1蛋白在AS组及AAV9-e GFP组的动脉粥样硬化斑块处均高表达(P<0.05);与AAV9-e GFP组相比,AAV9-CXCR4组DEL-1在斑块处表达明显减少(P<0.05),表明沉默CXCR4的表达,也成功抑制了DEL-1的表达;AS组和AAV9-e GFP组与CON组相比,CXCR4、SDF-1α、GSK-3β、CEBP-β、p-GSK-3β和p-CEBP-β的表达显著升高(P<0.05)。与AS组和AAV9-e GFP组相比,AAV9-CXCR4组上述蛋白表达显著降低(P<0.05),这表明沉默CXCR4可降低该途径的活性;与CON组相比,AS组和AAV9-e GFP组DEL-1下游炎性因子TNF-α、CXCL2和CCL3表达显著升高(P<0.05)。上述蛋白表达情况,与AS组和AAV9-e GFP组相比,AAV9-CXCR4组显著降低(P<0.05),AS组与AAV9-e GFP组间比较差异无统计学意义(P>0.05),免疫荧光结果显示:在CON中,DEL-1与CD68共定位未见或很少见;与CON比较,AS和AAV9-e GFP组巨噬细胞中可见DEL-1与CD68共定位(P<0.05);与AS组和AAV9-e GFP组相比,AAV9-CXCR4组中DEL-1与CD68共定位面积减少(P<0.05),这表明抑制DEL-1活性可使TNF-α、CXCL2和CCL3分泌减少。(3)DEL-1与GSK-3β/CEBP-β的关系及参与动脉粥样硬化的机制油红O染色结果显示:经油红O染色法染色后细胞被染成暗红色,胞质内可见粉红色或者橘红色颗粒,si RNADEL-1组与OX-LDL组比较,细胞变大,胞内脂质聚集变少,细胞质染色变浅,表明泡沫细胞模型建立成功且DEL-1促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成;WB、RT-PCR结果表明,在OX-LDL诱导下,细胞内DEL-1蛋白及m RNA水平较PMA组显著升高(P<0.05);但转染si-RNADEL-1后,DEL-1蛋白水平及m RNA水平较PMA组显著降Multiple markers of viral infections低(P<0.05);提示沉默DEL-1表达成功;WB结果显示:OX-LDL组、Si-NC组与PMA组比较,细胞内GSK-3β、CEBP-β、p-GSK-3β、p-CEBP-β蛋白水平显著升高(P<0.05);但在转染si-RNADEL-1后,GSK-3β、CEBP-β、p-GSK-3β、p-CEBP-β显著降低(P<0.05);RT-PCR、WB结果显示:与PMA组相比,OX-LDL或si-NC组中,GSK-3β/CEBP-β下游炎性因子TNF-α、MIP-1α、MIP-2的m RNA及的蛋白显著上升(P<0.05);与OX-LDL或si-NC组相比,在转染si-RNADEL-1PR-171浓度后,上述因子的m RNA及蛋白水平表达明显降低(P<0.05);提示成功沉默DEL-1后GSK-3β/CEBP-β通路活性及下游炎性因子表达也受到抑制。结论:(1)人体冠状动脉粥样斑块内DEL-1表达上调,冠状动脉粥样硬化斑块稳定变差。(2)CXCR4可通过GSK-3β/CEBP-β调控DEL-1介导的巨噬细胞分泌炎性因子加重炎性反应,导致小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性变差。