铜死亡是最近发现的一种由过量铜引起的调节细胞死亡形式,这种铜诱导的程序性细胞死亡形式不同于其他细胞死亡途径,包括细胞凋亡、铁死亡和焦亡。其特征为通过离子载体运输到线粒体中Cu(II)经FDX1还原为Cu(I),而数量增加的Cu(I)直接与三羧酸(TCA)循环的脂化组分(如DLAT)结合导致脂化蛋白聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定诱导蛋白质毒性应激和最终细胞死亡。研究表明铜死亡通过抑制癌细胞增殖和转移来发挥作用,槟榔导致的口腔鳞状细胞癌中,相关的槟榔碱刺激抑制铜死亡显著增加癌症相关纤维细胞的生存能力,通过促进上皮间质转化、癌症转移和化疗耐药性促进癌症进展;铜死亡可以对抗基于铂类化疗耐药性,谷胱甘肽可解毒顺铂对A549细胞的杀伤效果,而基于Cu(II)的纳米药物(Cu ET)表现出谷胱甘肽耐药细胞毒性并能有效逆转顺铂耐药。多西他赛是一种紫杉醇的半合成类似物,和强的松联合使用已成为晚期前列腺癌的一线标准化疗,其细胞毒性作用主要是通过结合到微管蛋白并抑制其解聚,使细胞无法分裂,发生细胞周期阻滞。然而超过一半的患者对多西他赛没有反应,而那些反应良好的患者经常经历显著的累积毒性发生耐药从而限制药物剂量持续时间和强度。癌细胞对抗化疗药物耐药性与代谢重编程有关,代谢可塑性使癌细胞能够增加对厌氧糖酵解代谢的依赖激活线粒体呼吸,对铜死亡高度敏感;在化疗药物和铜死亡双重压力下,癌细胞面临相反的压力,有助于防止癌细胞中耐药性的发展。总的来说,我们的研究揭示了铜死亡在前列腺癌中的一种新的抑制肿瘤增殖功能,通过DLAT/m Recidiva bioquímicaTOR通路抑制自噬进而增强前列腺癌细胞对多西他赛化疗敏感性,可能会为癌症的治疗提供新的见解。本研究由以下三部分组成:第一部分铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖及增强多西他赛药物敏感性目的:探讨铜离子对前列腺癌细胞系活力的影响,分析其是否增强多西他赛治疗前列腺癌的敏感性。方法:1.CCK8实验检测伊利司莫-氯化铜和多西他赛对PC-3和22RV1两种前列腺癌细胞系的抑制增殖的能力。2.CCK8实验和克隆形成检测铜离子螯合剂四硫钼酸盐(TTM)对前列腺癌细胞系抑制增殖的能力,Western blot检测铜死亡相关蛋白表达水平。3.实时定量PCR(q RT-PCR)分析药物处理后的前列腺癌细胞和TCGA数据库前列腺腺癌(PRAD)队列铜死亡基因表达情况筛选出差异性基因并在收集的前列腺癌和癌旁组织中验证;克隆形成和CCK8实验检测过表达该基因对前列腺癌细胞增殖能力的影响。结果:1.伊利司莫-氯化铜抑制前列腺癌细胞增殖,增强多西他赛的药物敏感性CCK8结果显示,伊利司莫-氯化铜对两种PCa细胞系(PC-3和22RV1)均以剂量依赖性的方式抑制细胞生长.多西他赛作为单药同样抑制了PC-3和22RV1细胞的增殖。伊利司莫-氯化铜与多西他赛的联合作用结果显示两种细胞系中加入铜离子均能明显增强多西他赛的药物作用。这表明铜和铜离子载体可以抑制前列腺癌细胞系的增殖,与多西他赛联合使用可增强多西他赛对前列腺癌细胞生长的抑制作用。2.伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖CCK8和克隆形成结果显示,相对于较低剂量的伊利司莫-氯化铜有效抑制前列腺癌细胞系的增殖,用高剂量的铜螯合剂四硫钼酸盐(TTM)才能抑制两种PCa细胞系的生长;而用较低剂量的TTM螯合铜离子可明显逆转伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞增殖抑制作用。进一步Western blot结果显示随着伊利司莫-氯化铜剂量的增加铜死亡标志蛋白DLAT、HSP70表达逐渐增强,而脂酰化蛋白Lip-DLAT的含量依次减弱。这些结果表明伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖。3.铜死亡促进DLAT的表达增强前列腺癌细胞对多西他赛的药物敏感性q RT-PCR结果显示与对照组和多西他赛组相比,伊利司莫-氯化铜组与药物联合组基因表达趋势相同且有显著差异性的基因仅有Lias、DLAT,结合TCGA数据库前列腺腺癌(PRAD)中相关铜死亡基因表达水平,最终确定铜死亡促进DLAT的表达。q RT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,DLAT在PRAD组织中低表达。使用慢病毒在PC-3细胞中过表达DLAT,CCK8和克隆形成结果显示过表达DLAT可以抑制前列腺癌细胞的增殖,与多西他赛联合使用可增强多西他赛对前列腺癌细胞杀伤作用。表明伊利司莫-氯化铜诱导的铜死亡促进DLAT的表达以增强多西他赛的药物敏感https://www.selleck.cn/products/AZD1152-HQPA.html性。小结:伊利司莫-氯化铜通过依赖铜离子诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖,铜死亡促进DLAT的表达增强多西他赛药物敏感性。第二部分DLAT介导铜死亡抑制多西他赛诱导的自噬增强前列腺癌细胞对多西他赛药物敏感性目的:研究伊利司莫-氯化铜增强前列腺癌细胞多西他赛药物敏感性的作用机制。方法:1.利用Western blot检测多西他赛、伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞自噬相关蛋白表达。2.克隆形成、细胞周期流式检测和透射电镜检测伊利司莫-氯化铜对前列腺癌细胞自噬的作用。3.q RT-PCR和Western blot检测过表达DLAT或敲低DLAT对前列腺癌细胞自噬相关蛋白表达的影响。4.细胞周期流式检测和透射电镜验证DLAT对细胞自噬的作用。结果:1.伊利司莫-氯化铜逆转多西他赛诱导的自噬相关蛋白的表达水平Western blot检测结果显示随着多西他赛浓度梯度及时间梯度增加,自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平逐步增加,P62蛋白水平依次减少。而随着伊利司莫-氯化铜剂量的增加LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平发生逆转,在加入铜螯合剂TTM后这种逆转作用被拮抗。以上结果表明,随着浓度及时间梯度增加,多西他赛可以诱导自噬相关蛋白的表达,而伊利司莫-氯化铜可逆转这种作用。2.伊利司莫-氯化铜通过抑制自噬增强前列腺癌细胞对多西他赛药物敏感性透射电镜对特征自噬小体超微结构分析结果显示,前列腺癌细胞经多西他赛药物刺激后诱导的自噬小体明显增加,而伊利司莫-氯化铜明显抑制自噬小体形成。克隆形成和细胞周期流式检测结果显示,在PC-3和22RV1细胞中,伊利司莫-氯化铜抑制前列腺癌细胞集落的增殖和促进细胞阻滞于G2/M期,与多西他赛联合治疗显著减少了集落数量和使大部分细胞阻滞于G2/M期。这表明伊利斯莫-氯化铜复合物通过铜死亡的方式抑制多西他赛诱导的自噬增加药物的敏感性。3.DLAT参与多西他赛调节前列腺癌细胞自噬q RT-PCR和Western blot结果显示,与BPH-1相比,LNCa P、22RV1及PC-3三个细胞系DLAT表达水平均降低,但PC-3表达水平最低,22RV1表达水平相对最高。进而在PC-3细胞中过表达DLAT,在22RV1细胞中敲低DLAT,结果显示过表达DLAT可抑制多西他赛诱导的LC3Ⅱ表达,相反敲低DLAT增加LC3Ⅱ表达水平,表明DLAT表达水平可以介导自噬相关蛋白的表达。4.DLAT促进细胞阻滞于G2/M期进而增强多西他赛药物敏感性透射电镜和细胞周期流式检测结果显示,在22RV1细胞中敲低DLAT,阻滞于G2/M期的细胞数量下降,而在PC-3细胞中过表达DLAT明显减少自噬小体的数量,进而促进细胞阻滞于G2/M期,联合多西他赛治疗时更进一步促进大多数细胞阻滞于G2/M期。以上结果表明,过表达DLAT通过抑制自噬增强多西他赛药物敏感性。小结:伊利司莫-氯化铜通过促进DLAT表达抑制自噬相关蛋白表达,进而增强前列腺癌细胞多西他赛药物敏感性。第三部分铜死亡通过DLAT/m TOR通路抑制自噬增强前列腺癌化疗敏感性目的:探讨DLAT介导多西他赛诱导自噬相关蛋白表达水平增强多西他赛药物敏感性的机制研究。方法:1.利用Western Fer-1blot实验检测自噬信号通路相关蛋白的表达水平,使用m TOR抑制剂雷帕霉素处理前列腺癌细胞并检测自噬相关蛋白的变化。2.构建裸鼠异种移植荷瘤模型,检测伊利司莫-氯化铜和多西他赛同时对PCa细胞肿瘤生长的影响。结果:1.DLAT促进m TOR磷酸化抑制自噬相关蛋白表达Western blot检测结果显示,多西他赛处理前列腺癌细胞后PI3K、AKT以及ERK磷酸化水平变化不明显,p-m TOR显著降低,进一步促进LC3Ⅱ表达;反之,在伊利司莫-氯化铜和过表达DLAT处理后,p-m TOR显著升高进而抑制LC3Ⅱ表达,而用m TOR通路抑制剂雷帕霉素处理,p-m TOR磷酸化水平被阻断,LC3Ⅱ表达水平再次升高。2.体内实验证实伊利司莫-氯化铜增强多西他赛抑制前列腺癌细胞增殖的能力在BALB/c裸鼠背侧皮下注射人源性前列腺癌PC-3细胞构建异种移植瘤模型。荷瘤成功后,每3天腹腔注射伊利司莫-氯化铜和或多西他赛,5个周期后处理小鼠取肿瘤组织。结果显示伊利司莫-氯化铜显著抑制移植肿瘤的生长,而联合多西他赛处理可进一步抑制肿瘤的进展。Western blot实验结果显示加入伊利司莫-氯化铜明显减少Lip-DLAT的表达和增加DLAT、HSP70的表达进而抑制LC3Ⅱ表达,免疫组化分析得到类似的结果。以上结果表明联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低PC-3异种移植瘤的自噬水平和抑制肿瘤进展。小结:DLAT靶向激活m TOR磷酸化进而抑制自噬相关蛋白表达;体内实验显示联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低异种移植瘤的自噬水平和抑制肿瘤进展。结论:1.伊利司莫-氯化铜诱导的铜死亡抑制前列腺癌细胞增殖,增强多西他赛药物敏感性。2.伊利司莫-氯化铜通过促进DLAT表达抑制自噬相关蛋白表达,进而增强多西他赛药物敏感性。3.DLAT促进m TOR磷酸化进而抑制自噬相关蛋白表达;联合伊利司莫-氯化铜和多西他赛可显著降低异种移植瘤的生长和细胞自噬,抑制肿瘤进展。