背景与目的牙周炎是最常见的口腔疾病之一,发病率高,是成年人牙齿缺失的首要原因,严重影响个人的生活质量。其特征性表现为牙周支持组织的进行性破坏。因此,重建牙周组织,实现其结构和功能再生成为牙周炎的理想治疗目标。基于干细胞的组织工程技术在实现组织再生方面取得了一定的进展,但移植干细胞体外扩增过程中存在复制性衰老、分化潜能减弱甚至丧失以及相关的免疫原性反应等问题,使其在临床转化过程中面临着巨大挑战。近年来的研究表明,移植间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)促组织再生的作用效果,主要是通过旁分泌功能实现的,其中外泌体(exosomes,EXs)扮演着至关重要的角色Lorlatinib NMR。与传统移植干细胞相比,EXs的应用不仅能够避免致畸、致瘤和致突变等生物安全性问题,而且其免疫原性更低、获取更容易、功能化修饰更方便,同时可以模拟干细胞的各种生物学行为。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)作为牙周再生的最佳细胞类型,其分泌的EXs也已被证实能够在炎症性牙周骨缺损中展现出优异的组织再生潜能。因此,PDLSC-EXs的临床应用为实现牙周组织的再生提供了新策略。然而其在转化过程中仍存在一些亟待解决的问题,如EXs获取率低、再生潜能尚待提升、靶向率仍需优化等。在相关机制方面,微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)被公认为是介导EXs参与组织修复与再生过程的关键分子。miRNA从细胞分泌到EXs以及随后发挥功能的过程,会因受到各种刺激条件的影响而发生特异性改变,从而影响EXs的生物学功能和再生潜能。课题组前期研究已经证实低氧预处理可以增强PDLSCs的生物学行为,如增殖、迁移、成骨分化等,从而促进牙周组织再生潜能。我们预实验结果初步表明:低氧预处理后的PDLSCs能够分泌更多EXs,其分泌的EXs更易被PDLSCs摄取。本研究拟在上述前期研究基础上,探索低氧预处理PDLSC-EXs的生物学功能及其促牙周组织再生潜能的影响,并初步阐释内在作用机制。研究成果有望加速EXs的临床转化进程,切实提升牙周组织再生效率,为牙周炎的治疗提供新的可行策略。材料与方法选用课题组前期筛选出的低氧条件处理PDLSCs,分离EXs并进行鉴定;探索低氧条件下PDLSC-EXs对PDLSCs增殖、迁移、成骨分化和免疫调节生物学功能的影响;采用甲基丙烯酰化明胶(gelatinmethacryloyl,GeIMA)凝胶分别负载两种不同处理条件的PDLSC-EXs,移植入大鼠牙周缺损模型,评价牙周组织再生效果;进一步通过高通量测序筛选低氧预处理前后PDLSC-EXs差异表达的miRNAs,微流控及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术进行验证,从而进行分子机制探索。结果低氧预处理PDLSC-EXs在粒径、表面蛋白表达和浓度等方面均优于常氧条件下的PDLSC-EXs;将常氧和低氧预处理来源PDLSC-EXs分别与PDLSCs、巨噬细胞共培养,结果发现低氧预处理下PDLSC-EXs一方面能够显著增强PDLSCs增殖、迁移和成骨分化能力,另一方面能显著促进巨噬细胞向M2型极化。将两种不同处理条件下的PDLSC-EXs负载GelMA凝胶移植入大鼠牙周缺损模型,Micro-CT和H&E染色结果均表明低氧预处理PDLSC-EXs促牙周组织再生潜能更为优异;免疫荧光染色结果表明低氧预处理PDLSC-EXs能够显著促进更多内源性干细胞的归巢;通过免疫荧光染色进一步证实低氧预处理PDLSC-EXs促进M2型巨噬细胞极化,从而利于组织修复。通过高通量测序分析低氧预处理前后PDLSC-EXs中差异表达的miRNAs,发现低氧条件下 2 个 miRNAs 发生了上调(hsPLX4032 IC50a-miR-125b-5p,novel-hsa-miR239-5p),3 个 miRNAs(hsa-miR-323a-3p,hsa-miR-3074-5p,hsa-miR-409-3p)发生了下调,采用微流控和qRT-PCR技术进行了初步验证,进一步预测了与增殖、迁移、成骨分化和免疫密切相关的20个靶基因及8条信号通路。结论低氧预处理可促进PDLSC-EXs分泌,提升PDLSC-EXs在缺损区域的组织再生效能,增强PDLSC-EXs对再生区域细胞的募集,并能促进募集干细胞的增殖及成骨分化能力,同时调控局部免疫反应,从而促进牙周组织再生。研究biopolymer gels成果可为牙周组织工程提供新策略,同时为阐明低氧刺激通过EXs调控再生微环境提供理论依据。