研究背景头颈鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是世界上发病率排名第六的恶性肿瘤,目前其临床影像学诊断主要通过传统成像方式,而其治疗则主要以手术治疗、放疗及化疗为主。其手术中仍然多采用视诊与扪诊相结合的方式探查肿瘤边界,依赖于主刀医生的临床经验,具有较大的主观性与个体差异性,存在着技术敏感性高,肿瘤边界鉴定困难等问题,因此对于HNSCC组织与正常组织鉴别的技术优化具有重要的改良意义。而利用荧光探针的成像功能,或可提供实时反馈的荧光成像,以此辅助术前影像诊断,并进一步在手术过程中辅助切除,可能成为解决上述问题的突破口。而选择合适的靶向策略,设计肿瘤特异性更为突出的荧光探针可以增强荧光探针的靶向性与选择性,以此达到更佳的肿瘤细胞识别效果。综上所述,基于上述临床问题,并秉持优化荧光探针靶向性能、强化HNSCC特异性的目的,本课题利用生物信息学技术选择新型靶向策略,并证实HNSCC的钠依赖性复合维生素转运体(Sodium-dependent multivitamin transporter,SMVT)差异性表达的情况,同时利用肿瘤微环境中潜在的过氧化亚硝酸盐(Peroxynitrite,ONOO-)高表达的生物微环境,设计了 RB-PN探针。该探针采用细胞膜表面SMVT主动靶向与ONOO-肿瘤微环境被动响应的双靶向机制,成像HNSCC细胞,区分肿瘤及正常细胞,并设计应用体内模型,证实其活体成像功能与生物安全性能,以验证其未来的临床应用潜能。同时采用SMVT及ONOO-的双靶向策略小分子荧光探针在此前还未见报道,而荧光探Femoral intima-media thickness针可视化在HNSCC中的应用亦处于起步阶段,RB-PN的研发及在HNSCC中的应用无疑具有较强的创新性和重要的研究价值。研究方法1.探针靶向策略选择,化学合成及性能表征测试。利用生物信息学数据库分析SMVGDC-0973T亚细胞表达位点及在HNSCC的肿瘤及癌旁组织中的表达情况,并利用免疫组化及免疫荧光技术在病人常规病理切片中验证其肿瘤与癌旁表达差异与细胞表达位点,确认探针靶向策略;利用该设计策略合成SMVT靶向,ONOO-响应的小分子荧光探针RB-PN,利用荧光滴定实验确认化学结构及表征。2.双靶向探针RB-PN在头颈癌细胞成像及鉴别中的应用研究。利用CCK-8法在头颈鳞癌细胞和正常对照细胞中验证RB-PN生物安全性,利用HOECHST染色法确认探针是否参与细胞凋亡;利用外源性ONOO-响应性与内源性ONOO-响应性测试确认探针ONOO-响应性;利用竞争性阻断实验确认SMVT靶向性;确认RB-PN的荧光成像实时反馈性及荧光稳定性;利用肿瘤细胞筛选实验确认探针的HNSCC细胞识别功能。3.双靶向探针RB-PN在3D肿瘤团块及体内荧光成像中的应用研究。建立3D肿瘤微团块模型,并采用IL-2与IFN-γ进行预处理,通过RB-PN进行三维成像与重建,拓展免疫治疗疗效的可视化潜在应用;构建斑马鱼生物模型,评价RB-PN活体成像性能;构建HNSCC荷瘤鼠模型,评估RB-PN的体内应用安全性及对重要脏器的生物毒性。4.针对头颈鳞癌的靶向策略潜在位点的预测。在双靶向探针RB-PN针对HNSCC靶向方案设计的基础上,进一步完善对HNSCC的靶向策略,总结针对HNSCC设计的荧光探针所利用的生物标志物;分析潜在生物靶点,作为未来荧光探针研发中针对HNSCC的靶向策略设计参考。研究结果1.成功制备基于双靶向策略设计的RB-PN探针并进行表征测试。对HNSCC中SMVT表达情况进行生物信息学分析,基于此进一步利用组织切片与免疫学技术进行验证,确认其可作为HNSCC靶向性荧光探针的策略选择。构建RB-PN荧光探针,利用核磁共振氢谱与碳谱确认了 RB-PN探针的化学结构,利用光谱测试实验进一步测试了RB-PN的化学响应时间,反应体系在575 nm处的荧光显著增强,5秒后即可观察到荧光信号,检测后1分钟左右荧光强度达到最大值并保持不变,其检测阈达到7 nM水平响应灵敏性,确认了探针良好的化学性能。2.双靶向策略荧光探针RB-PN在HNSCC细胞内具有良好的生物安全性与荧光成像性能,并具有良好的SMVT主动靶向性与ONOO-被动靶向性。利用不同浓度的RB-PN处理12小时后,细胞存活率仍然大于80%;HOECHST染色实验证实探针并未诱导或参与细胞凋亡;外源性与内源性ONOO-实验发现探针在HNSCC活细胞内可有效响应ONOO-,SMVT竞争性阻断实验也可见阻断组比对照组荧光强度显著降低;肿瘤筛选实验中RB-PN在HNSCC细胞中的荧光强度明显较高,成功筛选出HNSCC细胞;即刻成像实验与荧光稳定性实验证实了 RB-PN在活细胞内具有快速响应性与良好稳定的荧光成像性能,180分钟内均可观察到稳定荧光信号。3.双靶向策略荧光探针RB-PN在HNSCC肿瘤微团块与活体内具有良好的荧光成像性能,并具有较好的体内应用安全性。在构建的HNSCC肿瘤微团块中,相较于空白对照组,加入探针后相对荧光强度提升为1.77倍,而在细胞因子IFN-γ与IL-2干预下,荧光信号分别提升到空白对照组的2.32倍及2.85倍;在斑马鱼模型中,RB-PN成功在活体内实现荧光成像,并表现出良好的响应性能;在HNSCC荷瘤鼠模型中,RB-PN在注射12小时后,荷瘤鼠肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺、胃及肠道在内的脏器苏木精-伊红染色(Hematoxylin and eosin staining,H&E staining)确认了 RB-PN 对重要脏器无明显损伤,有良好的体内应用安全性。4.汇总并评估目前临床研究及临床前研究中的荧光探针的HNSCC靶向策略并预测未来潜在的靶向策略靶点。基于RB-PN针对HNSCC所设计的靶向策略优化,进一步深入探究更有效的HNSCC靶向措施,对目Panobinostat前临床研究及临床前研究中的荧光探针的HNSCC靶向策略进行汇总并利用生物信息学技术分析,同时预测了 HNSCC组织内过表达的38个基因(不同长度蛋白质数量为70个),其对应蛋白质亚细胞定位可表达于细胞膜表面,或可作为未来特异性针对HNSCC的荧光探针靶向策略的设计参考。研究结论本课题在利用生物信息学技术分析SMVT受体亚表达位点及表达量在HNSCC的肿瘤及癌旁正常组织中的表达情况,并通过免疫学技术验证后,设计了基于细胞膜表面SMVT主动靶向与ONOO-肿瘤微环境被动响应双靶向机制的荧光探针RB-PN,确认化学结构及表征,区分了 HNSCC及正常细胞,证实其具有良好的HNSCC细胞和肿瘤微团块荧光成像功能,并设计应用体内模型,证实其活体成像功能与生物安全性能,还进一步针拓展探讨HNSCC的肿瘤靶向策略,通过过各数据库检索及生物信息学分析,归纳并评估了现有的临床试验和临床前实验中的荧光探针靶向策略设计方案,并预测了针对HNSCC的主动靶向策略位点,为未来特异性针对HNSCC的荧光探针靶向方案提供理论基础和数据支持。