研究背景和目的慢性非传染性疾病(NCDs)严重危害公众健康,代谢性炎症是促进其发生发展的关键因素之一。棕榈酸(PA)是诱发代谢性炎症最主要的一种饱和脂肪酸。近年研究表明,巨噬细胞外泌体及其内含物可介导代谢性炎症。本课题组前期研究发现,PA刺激的巨噬细胞分泌的外泌体及其内含的miR-3064-5p能够介导正常巨噬细胞产生炎症,但其是否能够介导代谢性器官或组织(肝脏、脂肪、肌肉)产生炎症,尚不清楚。因此,本研究探讨PA刺激的原代巨噬细胞外泌体及其miR-3064-5p介导原代肝脏、脂肪和肌肉细胞产生炎症的作用,旨在为阐释棕榈酸诱发的代谢性炎症提供一种新机制,为防治代谢性炎症相关的NCDs提供新思路。方法1.用巯基乙酸盐培养基腹腔注射6周龄C57小鼠,灌洗出巨噬细胞,流式细胞术鉴定其纯度;2.用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞产生的外泌体,采用透射电镜、JNJ-42756493纳米粒径分析仪(NTA)和Western blot鉴定外泌体。3.用两步灌流法提取10周龄C57小鼠原代肝细胞;胶原酶消化结合组织块爬行法提取6周龄C57小鼠原代肌肉卫星细胞,MyoD蛋白免疫荧光鉴定后用马血清促其分化为肌管细胞;用胶原酶消化法提取10周龄C57小鼠原代前脂肪细胞,促分化为脂肪细胞后用油红O染色鉴定。4.用PA刺激小鼠原代巨噬细胞分泌的外泌体处理原代巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞和肌细胞,倒置荧光显微镜下观察四种细胞对PKH26标记的外泌体的摄取。用qPCR检测其miR-3064-5p表达水平,Western blot检测NF-κB信号通路中信号分子的表达水平。5.用miR-3064-5p mimics和inhibitor转染原代巨噬细胞、肝细DNA-based biosensor胞、脂肪细胞和肌细胞,用qPCR检测其miR-3064-5p表达水平,Western blot检测NF-κB信号通路中信号分子的表达水平,同时以外泌体分泌抑制剂GW4869处理作为对照。6.数据用SPSS 20.0统计软件进行两独立样本t检验或多组样本单因素方差分析,结果以Means±SD表示,p<0.05为统计差异显著。结果1.每只小鼠腹腔能够提取出纯度为(99.17±0.65)%、数量约为5×106的巨噬细胞。原代小鼠腹腔巨噬细胞分泌的外泌体在电镜下呈典型茶托样囊泡形态,粒径分布在100～200nm,表达CD63、CD9、TSG101外泌体标志蛋白。2.小鼠原代肝细胞镜下呈双核或多核的圆形结构;原代肌肉细胞诱导后能分化为肌管细胞;原代脂肪细胞诱导后能分泌脂滴。3.将PKH26荧光标记的外泌体处理四种原代细胞后均可在其细胞质中观察到荧光。4.PA刺激小鼠原代巨噬细胞分泌的外泌体显著增加了(pGDC-0068采购<0.05)四种小鼠原代细胞中 miR-3064-5p、COX-2、TNF-α和 p-p65 的水平,并降低了(p<0.05)IκBα蛋白表达。5.miR-3064-5p mimics 显著升高了(p<0.05)四种原代细胞中 miR-3064-5p、COX-2、TNF-α和 p-p65 的水平,并降低了(p<0.05)IκBα蛋白表达。GW4869处理小鼠原代巨噬细胞后获得的外泌体提取物对四种原代细胞无影响(p>0.05)。结论1.ExoQuick TC试剂盒法能够从小鼠原代巨噬细胞上清中提取高纯度的外泌体。2.小鼠原代巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞和肌细胞均能摄取小鼠原代巨噬细胞分泌的外泌体。3.PA刺激小鼠原代巨噬细胞产生的外泌体富含miR-3064-5p,其能靶向抑制IκBα,激活NF-κB信号通路,从而介导小鼠原代巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞和肌细胞产生代谢性炎症。