微生物细胞表面展示技术是通过基因克隆将目的蛋白基因与细胞表面蛋白基因融合并表达展示在微生物细胞表面的一种技术。在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示蛋白酶既避免了复杂、昂贵的酶的分离纯化过程,又由于芽孢的抗逆性赋予了展示蛋白酶更强的稳定性。双功能氨肽酶Aps是实验室前期筛选的来源于Pseudomonas aeruginosa GF31可降解拟除虫菊酯类农药的耐热氨肽酶,具有酶的催化杂化现象。既可作为氨肽酶水解以Leu-p NA为代表的肽酶特异性底物,在食品、医药与环境等多个领域具有广泛的使用前景。又具有酯酶活性,可降解多种拟除虫菊酯类农药,具有环境生物修复的应用潜力。本文利用表面展示技术将该酶展示至枯草芽孢杆菌芽孢表面,以期获得一种易分离且稳定性好的新型全细胞生物催化剂,为该酶的实际应用奠定基础,本文的研究内容主要分为以下三个方面:(1)芽孢表面展示氨肽酶工程菌的构建:通过对宿主菌、锚定蛋白、质粒载体的优化,成功构建了五株有活性的重组芽孢,并从中筛选出了氨肽酶活力最高的Bacillus subtilis WB600-PMA5-cot G-Aps。利用免疫荧光显微镜及Welstern Blot对目的蛋白进行定位表征,证明其在芽孢表面正确定位。随后对工程菌的表达条件进行优化,结果表明,在37℃、220 r/min的条件下培养72 h,氨肽酶活力表达最佳。(2)表面展示氨肽酶的肽酶活力优化及应用研究:测定表面展示氨肽酶在最适反应温度60℃,p H=Expression Analysis9.0的条件下,氨肽酶活力最高可达229.97 U/g芽孢,半衰期约为22 h。该酶在4℃、常温及-20℃条件下均具有良好的储藏稳定性,其中在4℃条件下,储藏稳定性最佳,储藏18周后,相对酶活力仍保留64.35%。另外,表面展示氨肽酶能耐受3 mol/L的Na Cl溶液,有利于拓展其应用范围。将表面展示氨肽酶复配碱性蛋白酶用于协同水解大豆蛋白,在60℃,碱性蛋白酶与表面展示氨肽酶的复配比例为2:1,水解p H先为10.0后为9.0的条件下,对浓度为5%(w/v)的大豆蛋白水解8 h,水解度可达55.50%,是表面展示氨肽酶及碱性蛋白酶单独水解时的4.3倍、1.5倍。其中疏水性氨基酸Leu、Tyr和Phe含量分别增加22.12 mg/L、9.47 mg/L和19.86 mg/L。鲜味氨基酸Glu、Asp含量增加15.06 mg/L、6.33 mg/L,说明表面展示氨肽酶在蛋白质的深度水解及对蛋白水解液的脱苦MRTX1133说明书、增鲜具有显著的作用。(3)表面展示氨肽酶的拟除虫菊酯降解活力测定及应用研究:表面展示氨肽酶对氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯等多种拟除虫菊酯类农药都具有降解作用,其中对高效氯氰菊酯selleck激酶抑制剂农药的降解效果最佳,降解最适条件为60℃,p H=8.0。分别考察了对于水体、土壤及果蔬表面高效氯氰菊酯农药的降解,结果如下:在最适条件下,降解水体中50 mg/L的高效氯氰菊酯农药72 h,降解率可达56.5%。对灭菌土壤中50 mg/kg的高效氯氰菊酯农药降解10天,降解率最高可达76.28%。对即食性水果(黄瓜)与蔬菜(生菜)表面低浓度农药残留的降解率分别达到57.49%与47.02%,高浓度农药残留的降解率分别达到62.79%与52.14%,说明表面展示氨肽酶具有环境生物修复及食品农残应急处理的应用潜力。