研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)恶性程度最高的颅脑肿瘤,预后极差。目前,GBM标准的治疗措施为手术切除病灶辅以术后的放疗及替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)口服的同步化疗,患者的中位生存期仅为14个月左右。肿瘤电场治疗(Tumor-treating fields,TTFields)作为胶质母细胞瘤最新的治疗手段,一定程度上提高的患者的生存期,但是整体治疗效果仍不尽人意。其他的治疗手段,如免疫疗法、基因疗法、溶瘤病毒疗法等仍处于起步阶段。胶质母细胞瘤大多数为浸润性生长,通常会浸润到正常的脑组织内,使手术切除病灶变得非常困难。此外,抑制性的肿瘤免疫微环境、胶质母细胞瘤低氧微环境、胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)的存在、复杂的基因突变、血脑屏障的限制是制约GBM治疗的重要因素。随着纳米技术手段的不断进步,各种有机、无机、天然的纳米颗粒开始在脑肿瘤治疗中尝试,具有血脑屏障穿透性的配体或靶向肽修饰开始应用于血脑屏障的穿透,为胶质母细胞瘤的治疗带来了新的变革。外泌体(Exosomes)是一种直径在30-150nm左右的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),内含脂质、蛋白质和核酸等物质,参与细胞的起源及细胞间的信号传递。外泌体被认为是治疗许多疾病的载体,如骨骼再生、心肌保护、组织修复等。最新研究发现,外泌体具有良好的生物相容性及穿透血脑屏障的能力,这种天然的生物学优势使其可用于颅脑疾病的治疗。但近期的研究发现,静脉注射的外泌体主要分布在肝脏及肾脏,注射的外泌体仅有很少的一部分保留在大脑或肿瘤部位。因此,开发可特定靶向胶质母细胞瘤的方法是一个关键的技术难题。利用物理、化学或基因修饰的方法修饰外泌体,制造用于药物或基因递送的工程化外泌体(Engineering exosome),可使外泌体获得更强的血脑屏障穿透能力及靶向递送水平。随着纳米技术的不变进步,磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)因其材料结构灵活、粒径小、超顺磁性、生物相容性等特点,在分析传感及生物医学领域应用广泛。其中,氧化铁纳米颗粒(Ironoxidenanoparticles,IONPs)在药物递送、磁共振成像和肿瘤治疗等领域都有对应的应用。因此,将磁性纳米材料的顺磁靶向性与工程化外泌体的主动靶向性结合,有望为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供一个新的治疗模式,实现多重靶向的递送策略。铁死亡(Ferroptosis)是一种近期新发现的调控细胞死亡的新方式,它由过度脂质过氧化所诱导。铁死亡主要在二价铁或脂氧合酶的作用下,催化不饱和脂肪酸,诱导细胞膜发生脂质氧化;此外,谷胱甘肽含量下降也是铁死亡的重要原因。但在脑肿瘤治疗领域,因血脑屏障的限制,制约了铁死HIV infection亡相关制剂在GBM中的应用;此外,最新研究发现,铁死亡中存在复杂的信号通路。因此,筛选出GBM中关键的铁死亡通路,并利用医工交叉的手段实现关键靶点药物的递送是我们本研究的重点。本研究中,我们设计了一种结合了工程化外泌体复合磁性纳米颗粒的复合治疗平台,通过靶向线粒体中两条协同铁死亡通路联合氧化铁纳米颗粒的二价铁离子释放实现了胶质母细胞瘤的铁死亡治疗。其中,磁性纳米颗粒由Fe3O4为内核,外壳为介孔SiO2,该壳核结构赋予了该体系磁靶向特性及药物封装能力;另一方面,工程化外泌体通过基因改造,拥有更强的血脑屏障穿透能力及胶质瘤靶向特性,通过电穿孔还可实现siRNA-GPX4的封装达到基因治疗目的。该复合体系一方面突破了血脑屏障的限制,提出了磁靶向及脑内主动靶向的新策略;另一方面探究了该治疗体系铁死亡疗法的具体机制,为胶质瘤的靶向递送策略提供了新的思路及方式。第一部分工程化外泌体复合磁纳米颗粒的设计与合成及其胶质母细胞瘤靶向能力的研究目的设计并合成工程化外泌体复合磁性纳米颗粒,并通过体内外实验检测其穿透血脑屏障、靶向胶质母细胞瘤的能力。方法1、工程化外泌体的设计与合成使用慢病毒基因修饰方式对人脂肪来源间充质干细胞进行基因改造,通过超速离心法获取基因修饰后的工程化外泌体,并通过Western Blot、透射电镜、粒径分析等方式对不同的外泌体进行表征。2、工程化外泌体靶向能力验证对提取的工程化外泌体及普通外泌体进行体外胶质瘤细胞靶向能力验证,通过共聚焦免疫荧光图像、流式细胞术等方式检测基因修饰后的工程化外泌体的GBM细胞主动靶向能力。3、磁性纳米颗粒的设计与合成设计并合成以Fe3O4为内核,介孔SiO2为外壳的磁性纳米颗粒,并利用化学修饰法对其表面进行改性,实现CD63抗体的枝接;通过扫描电镜、透射电镜、红外衍射、X线衍射、核磁共振等实验对材料结构及功能进行表征。4、工程化外泌体复合磁性纳米材料的构建及多重靶向能力验证通过孵育法合成外泌体与磁性纳米材料复合的纳米载体,并用共聚焦免疫荧光图像、透射电镜等方式对该复合体系进行表征,并进一步检测其生物相容性;构建小鼠3D打印的磁性头盔及小鼠荷瘤模型,通过小鼠体外生物成像、小鼠器官生物成像、小鼠颅脑电感耦合等离子体质谱、冰冻切片等方式对材料的多重靶向能力进行验证。结果selleck1、通过ANG-LAMP2B慢病毒基因修饰方式构建的工程化外泌体直径大小与正常外泌体接近且透射电镜提示其微观结构一致,Western Blot提示该外泌体具有丰富的EVs特异性蛋白指标,符合外泌体国际鉴定标准。2、免疫荧光及流式细胞术分析结果提示,ANG-LAMP2B基因修饰后的工程化外泌体具有更强的被GBM细胞吞噬的能力,其靶向能力与ANG靶向肽配体与GBM细胞中LRP1受体的相互结合密切相关。3、设计及合成的壳核结构Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒结构完整,介孔结构良好,磁靶向能力强,且具有良好的MRI成像能力。4、免疫荧光及透射电镜等表征结果提示混合孵育法获得的工程化外泌体复合纳米颗粒结构完整,体外生物相容性良好。小鼠体外生物成像、多脏器成像等结果提示复合工程化外泌体的磁性纳米材料可在小鼠脑内实现最强的脑肿瘤区域富集。结论1、ANG肽修饰的工程化外泌体具有更强的血脑屏障穿透能力及脑肿瘤靶向能力。2、ANG-L寻找更多AMP2B修饰的工程化外泌体复合磁性纳米材料结构均匀,可制备为多功能的纳米治疗平台。3、工程化外泌体复合磁性纳米颗粒联合3D打印磁性头盔可在小鼠体内实现脑肿瘤区域富集,为GBM的主动靶向治疗提供崭新模式。第二部分复合纳米颗粒介导的铁死亡疗法的作用机制及其应用研究目的探究胶质母细胞瘤中铁死亡相关通路,并进一步证实工程化外泌体复合磁性纳米颗粒介导的铁死亡疗法在胶质母细胞瘤治疗中的具体效果并探究其具体机制,进一步检测该靶向体系的生物相容性及安全性。方法1、胶质母细胞瘤中铁死亡通路关键靶点的关系验证通过GEPIA数据库生物信息学分析,不同胶质瘤细胞系Western Blot表达量检测及通路干扰实验,探究在GBM中铁死亡关键通路蛋白GPX4与DHODH的具体关系。2、铁死亡通路小干扰RNA及小分子抑制剂的装载针对铁死亡通路中关键靶点GPX4及DHODH,分别使用外泌体电转染的方式将GPX4的小干扰RNA封装在外泌体内,并通过孵育的方式将DHODH的小分子抑制剂Brequinar(BQR)封装在磁性纳米颗粒介孔SiO2的孔隙内,并通过pH释放实验、免疫荧光共定位实验鉴定两者的装载。3、体内外实验验证该复合治疗体系的综合铁死亡治疗效果体外细胞验证:分别通过CCK8实验、Western Blot蛋白表达量检测、丙二醛(MDA)测定、谷胱甘肽(GSH)含量测定、FerroOrange二价铁离子测定、ROS活性氧测定等实验检测该治疗平台在体外导致GBM细胞铁死亡的效果;体内实验验证:构建裸鼠胶质瘤模型,通过体外肿瘤发光成像、裸鼠生存期分析、H&E染色、铁死亡Marker免疫组化检测等方式评价该治疗体系体内治疗疗效。4、复合治疗体系的生物安全性评测通过小鼠多脏器H&E染色切片检测、小鼠血液系统指标检测、小鼠颅脑MRI等检测方式对该复合治疗体系的生物安全性进行综合评估。结果1、GEPIA数据库生信分析及胶质瘤细胞Western Blot蛋白表达量提示,与正常组织或正常星形胶质细胞相比,GBM中GPX4及DHODH的表达量上调,且通过siRNA敲低GPX4后,DHODH的表达量代偿性的上升。同时靶向这两条铁死亡通路是促进GBM铁死亡的有效模式。2、免疫荧光共定位提示通过电转染成功将siGPX4封装在了外泌体内,Western Blot结果提示与Lipo3000转染试剂相比电转染效率约为16.6%;紫外分光光度法提示低pH(pH=5.5)下介孔硅内BQR释放率更高。3、体外细胞实验提示该复合治疗体系可以明显促进细胞的铁死亡;裸鼠体内动物实验也得到了同样的结果,应用该复合治疗体系后肿瘤缩小,小鼠生存期明显延长且免疫组化结果提示肿瘤细胞发生了铁死亡。4、小鼠颅脑MRI结果提示该复合治疗体系可用于MRI成像且肿瘤大小明显缩小;小鼠多脏器H&E染色及血象检测提示应用该治疗体系无明显肝肾毒性及血液学改变,提示该治疗模式良好的生物安全性。结论1、同时靶向GPX4及DHODH通路是诱导胶质母细胞瘤铁死亡的有效方式。2、外泌体电穿孔siRNA-GPX4结合介孔硅装载DHODH靶点小分子抑制剂的复合治疗体系可在体内外有效诱导GBM铁死亡,且生物安全性良好。3、该复合治疗体系可以通过药物的多样选择成为胶质母细胞瘤的综合治疗平台,为胶质瘤的靶向治疗提供新的思路。