生物被膜(Biofilm)的形成是大肠杆菌产生耐药性的重要因素,第二信使分子环二鸟苷酸[bis-(3′-5′)-cyclic di-guanosine monophosphate,c-di-GMP]具有促进细菌生物被膜形成的作用。二鸟苷酸环化酶(Diguanylate cyclase,DGC)与磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)是合成与降解c-di-GMP的关键酶,二者通过感应结构域,传递环境信号,协同调节大肠杆菌胞内c-di-GMP水平,发挥对大肠杆菌生物学功能的调控作用。目前,对大肠杆菌寻找更多中不同DGCs的功能及其对胞内c-di-GMP水平的调节机制尚未完全解析。YeaJ(又称Dgc J)是一种二鸟腺苷酸环化酶,参与大肠杆菌生物被膜的形成,本研究前期研究发现敲除基因yea J后,大肠杆菌表现生物被膜形成能力降低、对抗菌药物敏感性增高的现象,但对YeaJ参与生物被膜的形成及细菌耐药性影响的研究还很缺乏。为了明确YeaJ在大肠杆菌耐药性形成中的作用和机制,本研究开展了YeaJ在大肠杆菌生物被膜形成中的作用及对抗生素耐药性的影响研究。获得以下结果:1.YeaJ影响大肠杆菌胞内环二鸟苷酸含量及对药物的敏感性(1)对敲除yea J基因的大肠杆菌生长性能、胞内c-di-GMP含量、生物被膜形成、药物敏感性等进行研究。结果发现yea J基因的缺失不影响大肠杆菌的生长性能,但细胞运动能力下降,卷曲菌毛和纤维素及浮游细胞胞外基质成分均降低;胞内c-di-GMP水平降低、生物被膜形成能力显著下降(P<0.01);对β-内酰胺类药物与氨基糖苷类药物抗生素敏感性显著增高(P<0.01)。结果表明,yea J基因缺失引起大肠杆菌胞内c-di-GMP水平降低,对抗生素的敏感性增高。(2)对127株大肠杆菌临床分离株的生物被膜形成能力、胞内c-di-GMP浓度、抗生素敏感性进行检测。结果发现,92.9%(118/127)的临床分离株具有生物被膜形成能力,形成生物被膜的菌株胞内c-di-GMP含量显著高于不形成生物被膜的菌株(P<0.01);c-di-GMP水平与头孢他啶敏感性呈中度正相关(r=0.6102);形成生物被膜的菌株对β内酰胺类和氨基糖苷类耐药性显著高于不形成生物被膜的菌株(P<0.01);生物被膜形成菌株与氨苄青霉素敏感性(r=0.8399)和头孢他啶敏感性(r=0.7117)显著正相关。结果表明,生物被膜形成能力与胞内c-di-GMP水平影响大肠杆菌对药物的敏感性。2.YeaJ调控大肠杆菌生物被膜形成基因的转录水平利用转录组高通量测序技术筛选野生菌株与yea J缺失菌株的差异转录基因。分析发现,yea J的缺失显著影响了大肠杆菌中与生物膜形成相关的五种生物功能的基因表达谱,其中鞭毛组装与卷曲菌毛合成的9种负调控基因(flg E、ycg Z、ttd A、ttd B、ttd R、tom B、hha、ecp E、ecp D)上调,生物被膜基质成分脂多糖LPS脂质A结构修饰的5种基因(pag P、arn A、arn B、arn C、ept A)及4种肽聚糖水解酶基因[deg P,dsd A,ldt C,pbp6(dac C)]、4种趋化MDV3100作用性基因(tsr,che A,che B,che Z)、AST途径的5种精氨酸分解代谢基因(ast A,ast B,ast C,ast D,ast E)均出现下调。结果提示,YeaJ调控大肠杆菌生物被膜形成基因的转录。3.YeaJ通过与大肠杆菌生物被膜形成关键胞内蛋白的互作影响其药物敏感性(1)通过GST Pull-down试验、LC-MS/MS质谱技术、细菌双杂交系统鉴定YeaJ互作的大肠杆菌胞内蛋白。结果发现,YeaJ可与大肠杆菌生物被膜形成的关键蛋白互作,包括鞭毛组装蛋白(CRR、CRP、Ydi V)、卷曲菌毛合成调控蛋白(Acr A、Acr B、Omp R、Rpo A)、生物被膜基质成分(LPS脂质A结构修饰酶Arn A,肽聚糖水解酶PBP4、PBP6、Deg P)、趋化性受体蛋白(Aer)、精氨酸合成酶(Arg A,Arg B)。(2)检测YeaJ与drugs and medicines互作蛋白Ydi V、Arn A、Dac B、Aer、Arg R的基因单缺失菌株(Δydi V,Δarn A,Δdac B,Δaer,Δarg R)、双缺失菌株(Δyea JΔarn A,Δyea JΔdac B,Δyea JΔaer,Δyea JΔarg R)的生物被膜形成能力及药物敏感性。结果发现ydi V单基因缺失的大肠杆菌生物被膜形成能力增强(P<0.01),对药物的敏感性降低;ydi V与che Y双基因缺失的大肠杆菌运动性完全丧失(P<0.01);yea J和arn A双基因缺失的大肠杆菌细胞膜渗透性增大(P<0.01),提高了对多黏菌素类药物的敏感性;yea J和dac B双基因缺失的大肠杆菌中含D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)肽聚糖前体蛋白增多,提高了对头孢他啶的敏感性;yea J和aer双基因缺失的大肠杆菌显著降低了大肠杆菌的运动能力(P<0.01),但对药物的敏感性无显著影响;yea J和arg R双基因缺失的大肠杆菌精氨酸代谢水平降低(P<0.01),对头孢他啶的敏感性增强,但对多黏菌素的敏感性无影响。结果表明,5种与YeaJ互作的大肠杆菌胞内蛋白通过影响生物被膜的形成,显著影响大肠杆菌对不同药物的敏感性。(3)蛋白结构域互作试验结果表明,YeaJ与互作蛋白的作用机制是识别互作蛋白的特定结构域,结果显示YeaJ全长序列可与鞭毛主调控蛋白Flh DC结合的Ydi V结构域EAL结合;YeaJ周质感应结构域GAPES1识别Arn A结构域GDP-Man-Dehyd/UDPgalactose-4-epimerase,PBP4结构域Peptides13-β-actase2、Aer感应结构域(PAS、HAMP、MCP)及Arg B结构域AAK结合,影响大肠杆菌生物被膜的形成。4.大肠杆菌YeaJ转录因子的鉴定采用EMSA试验对大肠杆菌YeaJ转录因子进行鉴定,结果表明,yea J基因上游2000 bp区域内有5个活性启动子,转录因子FNR直接与yea J上游0～-270 bp近端启动子内80 bp的DNA序列结合,激活yea J基因转录,促进YeaJ表达并参与生物被膜形成,提高了大肠杆菌对头孢他啶、丁胺卡那耐受性。综上,FNR是YeaJ的转录因子,YeaJ通过与互作蛋白特定的结构域的结合而发挥调控作用,YeaJ可调控大肠杆菌c-di-GMP水平,进而影响大肠杆菌生物被膜的形成而改变其对不同类型药物的敏感性。本研究从一个新的视角研究了二鸟苷酸环化酶—YeaJ在大肠杆菌耐药性形成中的作用,发现YeaJ不仅仅是一种合成第二信使的酶,它还可通过与胞内蛋白的互作,影响大肠杆菌生物被膜的形成,改变其对不同药物的感受性,研究结果丰富了对大肠杆菌耐药性形成机制的新资料和新认识。