目的:通过对银屑病模型小鼠及Ha Ca T细胞的研究,探讨Spred2蛋白与Ras/ERK通路的相关性;验证Spred2与NBR1结合与Ras/ERK通路的相关性;通过中药干预实验,探讨清血毒胶囊基于Spred2/Ras/ERK通路治疗银屑病的可能性,为从毒论治银屑病提供实验依据。方法:1.Spred2过表达动物实验:SPF级BALB/C雄性小鼠随机分为6组,造模三组予以化学诱导法咪喹莫特构建银屑病模型小鼠,凡士林组予以等量凡士林乳膏干预,造模三Oral probiotic组为模型组、空载病毒II组及过表达II组,凡士林组为正常组、空载I组及过表达I组,每组各8只。实验开始前2天,空载I、II组及过表达I、II组分别予以空载病毒及Spred2过表达腺病毒感染,感染方式为微针原位感染,正常组和模型组予以生理盐水干预。造模7天后,颈椎脱臼处死取样。实验期间观察小鼠的一般情况、皮肤状态、PASI评分变化等,检测并统计各组小鼠样本的组织病理变化,Western Blot和RT-PCR实验观察银屑病样小鼠皮损Spred2蛋白及m RNA表达及Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达。2.Spred2过表达细胞实验:体外培养Ha Ca T细胞,利用IL-22和TNF-构建银屑病细胞模型。分为四组,正常组,模型组、空载组和过表达组。正常组不予任何干预措施,空载组和过表达组在模型组的基础上分别感染空载病毒及Spred2过表达腺病毒,PCR检测Spred2蛋白m RNA表达,验证过表达建立模型。CCK8法及流式细胞法检测各组细胞增殖及凋亡情况,ELISA法检测各组细胞IL-6和IL-1表达水平,WB和RT-PCR实验检测各组Spred2蛋白及m RNA表达及Ras/ERK通路相关蛋白表达水平。此外,免疫共沉淀实验比较各组细胞Spred2与NBR1共结合。3.中药干预实验:SPF级BALB/C雄性小鼠随机分为4组,正常组、模型组、复方青黛胶囊组和清血毒胶囊组,采用咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型,正常组予凡士林干预,中药组造模后予以分别予以复方青黛胶囊及清血毒胶囊灌胃,正常组及造模组予以等量蒸馏水灌胃。各组小此网站鼠擦药3小时后,予以灌胃,连续7天,7天后颈椎脱臼处死取样。实验期间观察各组小鼠一般情况,皮肤变化及PASI评分,取样后观察小鼠组织病理变化,Western Blot和RT-PCR实验检测各组Spred2蛋白及m RNA表达,以及Ras/ERK通路相关蛋白表达水平。此外,免疫荧光共聚焦检测各组Spred2及NBR1结合。结果:1.Spred2过表达动物实验中,与正常组及空载I组相比,过表达I组Spred2蛋白及m RNA水平显著升高(<0.001);而空载I组与过表达I组相比Spred2蛋白及m RNA水平差异无统计学意义(>0.05)。与空载II组、模型组相比,过表达II组的PASI评分明显降低(<0.05),Baker评分显著下降(<0.01),且皮肤病理改变也较模型组、空载II组更轻,这表明Spred2过表达一定程度上可减轻银屑病小鼠皮肤病理改变及银屑病红斑、鳞屑等相关症状。空载II组与模型组相比,其Raf1 m RNA、Ras m RNA、ERK1 m RNA、ERK2 m RNA、VEGFA m RNA表达及蛋白表达无显著性差异(>0.05);而与模型组相比,过表达II组的Raf1 m RNA、Ras m RNA、ERK1 m RNA、ERK2 m RNA、VEGFA m RNA表达及蛋白表达显著下降(<0.001),进一步说明Spred2蛋白表达升高可抑制Ras/ERK通路相关m RNA表达。2.Spred2过表达细胞实验中,与模型组相比,空载组Spred2蛋白及m RNA水平差异无统计学意义(>0.05);而过表达组Spred2蛋白及m RNA水平显著升高(<0.01)。CCK8增殖结果及流式凋亡率显示,与模型组相比,过表达组细胞增殖明显降低(<0.01);而细胞凋亡率明显升高(<0.01),这表明Spred2蛋白过表达可抑制银屑病Ha Ca T细胞的增殖、促进凋亡。与模型组相比,过表达组IL-1、IL-6蛋白含量明显降低(<0.01),这表明Spred2过表达可抑制银屑病Ha Ca T细胞相关炎症因子的表达。与正常组相比,模型组的Ras/ERK相关通路蛋白及m RNA含量明显上调(<0.01);而与之相反,过表达组与模型组在该途径相关Raf1 m RNA、Ras m RNA、ERK1 m RNA、ERK2 m RNA、VEGFA m RNA表达及蛋白表达显著下降(<0.001),进一步说明Spred2蛋白表达升高可抑制Ras/ERK通路相Tezacaftor抑制剂关m RNA表达。免疫共沉淀检测结果发现,与空载组相比,过表达组的Spred2和NBR1结合更强,且蛋白表达更强。这表明过表达Spred2蛋白可增强银屑病Ha Ca T细胞中Spred2与NBR1的结合;进而增强对Ras/ERK通路的抑制作用。3.中药干预实验中,与模型组相比,复方青黛组及清血毒组的PASI评分及Baker评分均显著降低(<0.01);同时清血毒组小鼠的红斑、皮肤肥厚、脱屑等症状改善程度均优于复方青黛组,且PASI评分更低于复方青黛组(<0.01),且Baker评分低于复方青黛组(<0.05),这表明清血毒胶囊对银屑病模型小鼠症状及病理程度的改善均优于复方青黛组。与模型组及复方青黛组对比,清血毒组的Spred2蛋白及m RNA表达明显升高(<0.01);而复方青黛组与模型组对比,其Spred2蛋白及m RNA表达变化无统计学意义(>0.05)。这证明复方青黛胶囊则不是通过调控Spred2蛋白参与银屑病的发病过程,而清血毒胶囊则是通过调控Spred2蛋白以参与银屑病。与正常组相比,模型组的p-ERK、ERK、p-Ras、Ras、p-Raf1、Raf1、VEGFA蛋白表达明显下降(<0.001);而与模型组相比,青黛组及清血毒组的p-ERK、ERK、p-Ras、Ras、p-Raf1、Raf1、VEGFA蛋白及m RNA表达均有所下降(<0.001);然而,值得注意的是,清血毒组Ras/ERK通路相关蛋白表达水平更加低于复方青黛组,且两组相比较p-ERK、p-Ras、p-Raf1、VEGFA有明显差异(<0.01)。另外,我们发现,模型组的Spred2与NBR1的结合相较于正常组明显减弱(<0.001)。与模型组相比,青黛组的Spred2蛋白及NBR1蛋白累积光密度值(IOD)虽然轻度增加,但其变化没有统计学意义(>0.05);反之,与模型组及青黛组相比,清血毒组Spred2蛋白及NBR1蛋白的IOD值明显升高,且差异具有显著性(<0.01)。这表明复方青黛胶囊不能促进Spred2蛋白与NBR1蛋白的结合,而清血毒胶囊可能通过增强Spred2与NBR1的结合以增强对Ras/ERK通路的抑制作用,以增强治疗银屑病的作用。结论:1.银屑病模型小鼠皮肤组织中,Spred2蛋白的表达减少,与此同时Ras/ERK通路相关蛋白和m RNA的表达增加。与之相反,提高Spred2蛋白表达则能够抑制该路径相关蛋白和m RNA的表达,从而减轻银屑病小鼠模型的症状,改善与银屑病相关的病理表现。2.在银屑病细胞模型中,过表达Spred2可抑制Ha Ca T细胞增殖,促进细胞凋亡,减轻炎症因子表达,增强与NBR1的结合并抑制Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达。3.发现清血毒胶囊治疗银屑病的可能机制:通过增强Spred2蛋白表达,加强Spred2与NBR1的结合,抑制Ras/ERK通路相关蛋白表达。