目的:本研究利用全碳氢构象锁定策略对天蚕素进行订书修饰,以探究“订书钉”样的化学修饰手段是否会对天蚕素的药物特性产生积极影响。结合高效液相色谱法(HPLC)和圆二色谱法(CD)分析鉴定多肽的纯度和二级结构,采用CCK-8试剂进行荧光检测法测定订书修饰后的多肽毒性差异,通过生物原核转录组测序以探究优选订书肽CEC-2-9的抗菌机制。方法:(1)设计与合成:利用传统的多肽固相合成法(SPPS)法合成天蚕素系列订书肽,经Waters高效液相分析鉴定多肽的纯度,使用Q-TOF质谱分析多肽分子量组成。(2)体外抗菌活性试验:采用微量肉汤二倍稀释法测定天蚕素系列订书肽的最低抑菌浓度值,探索订书修饰后的天蚕素是否能发挥更加广谱的、强效的抗菌作用。(3)螺旋度测试:使用Jasco-815圆二色谱仪测试天蚕素系列订书肽的螺旋度。(4)蛋白稳定性测试:使用糜蛋白酶和胰蛋白酶与多肽共孵育检测蛋白稳定性,测试天蚕素系列订书肽在蛋白酶中的降解Micro biological survey程度。(5)细胞毒性实验:实验使用CCK-8试剂分析检测多肽与人血红细胞孵育后的溶血程度及多肽对RAW264.7的细胞毒性大小,计算得到每条多肽的HC_(50)值和IC_(50)值。(6)体内抗菌实验:实验以E.coli ATCC25922菌株建立小鼠脓毒症模型,采用菌落计数法作为天蚕素原肽和订书肽体内治疗的抗菌作用。(7)抗菌机制:对天蚕素优选订书肽采用原核转录组测序技术,经过GO通路和KEGG通路分析显著差异基因,筛选并鉴定出天蚕素优选订书肽抗菌机制的相关生物信息。结果:(1)体外抗菌活性实验:CEC-2系列MIC值显著低于原肽CEC-0,并且相比于CEC-1系列订书肽,CEC-2系列订书肽更能更有效的抑制有害细菌,订书修饰的天蚕素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性显著高于天然天蚕素。(2)螺旋度测试:经CD值计算分析得到原肽CEC-0的螺旋度为18.99%,优选肽CEC-2-9的螺旋度为20.51%,其他大部分订书肽的螺旋度均高于原肽。(3)蛋白稳定性实验:胰蛋白酶和糜蛋白酶降解实验结果表明,原肽和订书肽在4小时的剩余含量不相上下selleck Alisertib,故二者的蛋白稳定性相似。(4)细胞毒性试验:溶血实验结果表明订书策略能够提高天蚕素的溶血活性,因为与CEC-0相比,CEC-2-9的HC_(50)值显著提高;RAW264.7细胞毒性实验进一步验证了CEC-2-9的IC_(50)值较原肽CEC-0更低,订书修饰后RAW264.7细胞的毒性有所增加。(5)体内抗菌活性测试:通过菌落计数实验结果得知,与对照组CEC-0相比,CEC-2-9给药后大肠杆菌生长情况明显减少,抗菌活性显著提升。(6)抗菌机制:将原核转录组测序结果进行通路分析可知CEC-2-9能够发挥抗菌作用的机制是影响了细胞的磷酸戊糖代谢过程(Pentose phosphate pathway,PPP),以至于消极干预了细菌细胞中核酸的合成,进而起到强大的广谱抗菌作用。结论:具有广Puromycin泛化学多样性的抗菌肽能够成为未来药物开发以及新化合物提供的重要来源,而订书修饰策略可以有效地增强多肽的螺旋度、提高蛋白稳定性,本研究提供的优选订书肽CEC-2-9有潜力成为新型广谱抗菌药物,经过临床进一步研究后,有望开发为新药。这对降低抗生素耐药性及预防传染病具有重要意义,对医药研究、畜牧行业以及科技民生的发展进程影响极大。