饮用水消毒可以消除水中绝大部分病原微生物,与此同时,消毒剂与源水中天然存在的有机物或者环境污染物发生反应,从而有大量新的化合物生成,即消毒副产物(disinfection byproducts,DBPs)。卤代苯醌(halobenzoquinones,HBQs)是一类新型饮水DBPs,在消毒后的饮水和泳池水中均有检出,其中以2,6-二氯-1,4-苯醌(2,6-dichloro-1,4-benzoquinone,DCBQ)在水中的含量最高、检出率最广泛,作为本课题研究对象。HBQs具有极强的细胞毒性,毒性作用比某些饮用水卫生标准管控的DBPs高10～1000倍,HBQs带来的健康风险越来越受到关注。然而目前HBQs毒理学的研究数据仍需进一步完善,HBQs潜在的神经发育毒性的研究报道较少,作用机制并不十分清楚。本研究中采用体内和体外实验相结合的方法,建立整个孕期和哺乳期DCBQ暴露的大鼠模型,研究DCBQ对子代大鼠的神经发育毒性;给予分化中SH-SY5Y细胞DCBQ暴露,探讨DCBQ对神经细胞增殖、神经分化、氧化损伤和细胞凋亡的影响;并深入探讨氧化应激介导的线粒体凋亡通路和PI3K/AKT/mTOR通路在DCBQ神经发育毒性中的作用,以期进一步揭示HBQs神经发育毒性的作用靶点和分子机制,也为进一步研究其他DBPs的神经发育毒性作用及机制提供新的思路。第一部分DCBQ对子代大鼠神经发育毒性和神经细胞分化的影响目的:本部分实验建立整个孕期和哺乳期DCBQ暴露的大鼠模型,探究DCBQ对子代大鼠的神经发育毒性;并以维甲酸(retinoic acid,RA)诱导SH-SY5Y细胞建立神经细胞分化模型,探讨DCBQ对神经细胞增殖、神经分化、氧化损伤和细胞凋亡的影响,进一步明确DCBQ的神经毒性作用。方法:1.体内实验选择SPF级体重240～260 g的健康成年SD大鼠。在SPF屏障饲养1周后,确认细节大鼠按雌雄1∶1比例合笼,次日晨检查发现阴栓的雌鼠即为受孕成功,并将孕鼠随机分至四组,即溶剂对照组(医用芝麻油)、0.5 mg/kg DCBQ组、5 mg/kg DCBQ组和50 mg/kg DCBQ组,每组10只。自成功受孕之日起开始染毒,至哺乳期结束后终止染毒,持续6周,于每日上午相对固定的时间灌胃染毒1次,每日观察母鼠状态,并每两日记录母鼠体重变化,染毒完成后处死母鼠。子代大鼠断乳后,雌雄分笼饲养。在子代大鼠4周龄、8周龄时,运用Morris水迷宫检测其空间学习和记忆的功能;运用旷场实验检测子代大鼠的自主探索和运动功能。完成行为学测试后,处死子代大鼠,收集和称重脑组织。HE染色和尼氏染色法观察4周龄和8周龄子代大鼠大脑皮层病理变化。2.体外实验采用CCK-8法测定不同浓度的DCBQ染毒神经分化中的SH-SY5Y细胞24 h、48 h和72 h后对细胞活力的影响;根据实验结果,确定后续染毒剂量,即设定6.75、13.5和27.0μM为DCBQ染毒的低、中和高剂量组。在RA诱导SH-SY5Y细胞神经分化的过程中,给予细胞不同剂量DCBQ暴露。应用流式细胞术和Western-Blot两种方法检测DCBQ暴露后分化中的SH-SY5Y细胞神经分化标志性蛋白β-Tubulin含量的变化,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的生成,罗丹明123检测线粒体膜电位水平,流式细胞术和Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况。应用SPSS 25.0和Graph Pad Prism 8.0软件进行数据分析,数据以均数±标准差((?)±s)表示,多组间差异应用单因素方差分析,两两间比较应用LSD检验。检验水准设定为P<0.05有统计学差异。结果:1.体内实验(1)自孕鼠染毒第14天开始,50 mg/kg DCBQ组母鼠体重较其他组别呈现出下降趋势,且在整个哺乳期,尤其是哺乳期的前14天,母鼠体重仍显著低于其他组别(P<0.05)。(2)与对照组相比,5 mg/kg和50 mg/kg DCBQ暴露组子代大鼠脑脏器系数在4周龄和8周龄均显著下降(P<0.05)。(3)Morris水迷宫实验发现,随着母鼠DCBQ暴露剂量的增加,子代大鼠的运动轨迹明显偏离平台以及平台象限,围绕在水池边缘的活动明显增多;且与对照组相比,5 mg/kg和50 mg/kg DCBQ组子代大鼠进入目标象限及穿越平台次数明显减少(P<0.05)。旷场实验发现,随着母鼠DCBQ暴露剂量增加,子代大鼠围绕在旷场边缘区域的活动明显增多,5 mg/kg DCBQ和50 mg/kg DCBQ组子代大鼠活动总路程及平均速度与对照组相比明显下降(P<0.05)。(4)DCBQ暴露后,子代大鼠大脑皮层神经纤维结构紊乱疏松,核固缩,染色较深,可见“空泡化”,尼氏体溶解消失,数量明显减少,尤其是5 mg/kg和50 mg/kg DCBQ组病理改变较为明显。2.体外实验(1)DCBQ对分化中的SH-SY5Y细胞具有明显的增殖抑制作用,随着染毒浓度增加及作用时间的延长,细胞的活力明显下降,呈现出剂量和时间依赖关系。(2)流式细胞术检测分化中的SH-SY5Y细胞β-Tubulin含量,随着DCBQ染毒剂量的增加,β-Tubulin含量出现下降趋势,高剂量组与对照组和低剂量组比较差异具有统计学意义(P<0.05);Western-Blot检测β-Tubulin蛋白表达,随着DCBQ染毒剂量的增加,β-Tubulin蛋白水平在中、高剂量组呈现出显著的下降,中剂量组与对照组、高剂量组与其它各组间比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)DCBQ显著增加了分化中的SH-SY5Y细胞内ROS的产生,各剂量组的ROS生成水平均明显高于对照组(P<0.05)。(4)随着DCBQ染毒剂量的增加,分化中的SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位呈下降趋势,中剂量组、高剂量组显著低于对照组(P<0.05),且高剂量组线粒体膜电位显著低于低剂量和中剂量组(P<0.05)。(5)DCBQ高剂量组细胞的早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率明显高于对照组,随着DCBQ染毒剂量的增加,细胞的总凋亡率呈现出上升趋势,DCBQ低、中和高剂量组的总凋亡率之间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.母鼠DCBQ暴露可引起子代大鼠脑脏器系数的下降。2.母鼠DCBQ暴露可改变子代大鼠大脑皮层病理结构。3.母鼠DCBQ暴露可损害子代大鼠的空间学习记忆和自主运动功能。4.DCBQ可抑制分化中的SH-SY5Y细胞的细胞增殖。5.DCBQ可抑制分化中的SH-SY5Y细胞的β-Tubulin的表达,提示DCBQ可抑制SH-SY5Y细胞的神经分化水平。6.DCBQ可增加细胞内ROS,降低线粒体膜电位和增加细胞凋亡率,提示DCBQ暴露对分化中的SH-SY5Y细胞具有毒性作用。第二部分氧化应激介导的线粒体凋亡通路在DCBQ神经发育毒性中的作用及机制目的:本部分研究检测了母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠4周龄和8周龄大脑皮层中氧化损伤指标和线粒体凋亡通路的变化;并选用神经分化中的SH-SY5Y细胞为细胞模型,应用抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),明确NAC对DCBQ诱导SH-SY5Y细胞毒性作用的影响,探讨氧化应激在DCBQ影响神经分化中的作用及可能的机制。方法:1.体内实验实验分组与DCBQ染毒同第一部分。TBA法测定子代大鼠大脑皮层中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;紫外比色法测定大脑皮层中蛋白质羰基含量;免疫组化法检测大脑皮层中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)表达情况;实时定量PCR检测子鼠大脑皮层组织中线粒体凋亡通路关键基因Cyt-C、Caspase9和Caspase 3的mRNA表达水平;Western-Blot检测大脑皮层组织中Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3蛋白表达水平。2.体外实验本部分实验中选择DCBQ作用浓度13.5μM作为细胞的染毒剂量。实验分为阴性对照组(Control)、NAC组、DCBQ组和NAC+DCBQ组四个剂量组。细胞增殖、β-Tubulin蛋白表达、线粒体膜电位和细胞凋亡率的检测方法同第一部分。实时定量PCR检测分化中的SH-SY5Y细胞线粒体凋亡通路关键因子Cyt-C、Caspase 9、Caspase 3和PI3K/AKT/mTOR通路中PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达水平;Western-Blot检测细胞中Cyt-C、Caspase 9、Caspase 3、PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平。结果:1.体内实验(1)母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠大脑皮层中MDA水平随DCBQ暴露剂量的增加而逐渐上升,0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg DCBQ暴露组子代大鼠脑皮层中含量均明显高于对照组,且50 mg/kg DCBQ组MDA含量同时显著高于0.5 mg/kg和5mg/kg DCBQ组(P<0.05)。(2)与对照组相比,0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg DCBQ暴露组的子代大鼠大脑皮层中蛋白质羰基含量均呈显著升高(P<0.05)。(3)与对照组相比,母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠大脑皮层中i NOS免疫阳性反应明显增强;且随着暴露剂量的增加,i NOS阳性细胞的表达水平呈现逐渐升高趋势,以50mg/kg DCBQ组表达水平最高,各组间表达水平两两相比,均具有统计学差异(P<0.05)。(4)母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠大脑皮层中的Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3mRNA和蛋白表达水平均呈显著上调。2.体外实验(1)NAC+DCBQ组SH-SY5Y细胞活力较DCBQ组显著提高(P<0.05),基本恢复到对照组水平。(2)NAC+DCBQ组细胞β-Tubulin蛋白表达较DCBQ组显著升高(P<0.05)。(3)NAC+DCBQ组的线粒体膜电位,与DCBQ组相比较明显回升,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与DCBQ暴露组相比,NAC+DCBQ组晚凋和总凋亡细胞百分比显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(5)DCBQ暴露后,分化中的SH-SY5Y细胞的Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3 mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著升高(P<0.05);NAC+DCBQ组细胞中Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3 mRNA及蛋白表达水平显著低于DCBQ组(P<0.05)。(6)DCBQ暴露后,分化中的SH-SY5Y细胞的PI3K和AKT mRNA及蛋白表达水平与对照组相比均显著降低(P<0.05),mTOR表达水平与对照组相比也呈下降趋势,但无统计学差异;与DCBQ组相比,NAC+DCBQ组细胞中PI3K、AKT和mTOR mRNA及蛋白表达水平显著回升(P<0.05)。结论:1.母鼠DCBQ暴露可加重子代大鼠大脑皮层的氧化应激损伤。2.母鼠DCBQ暴露可影响子代大鼠大脑皮层线粒体凋亡通路关键基因mRNA和蛋白表达。3.抑制氧化应激后,可使DCBQ诱导的SH-SY5Y细胞活力上升、ROS产生下降、促进确认细节神经分化、线粒体膜电位恢复和细胞凋亡率下降,证明抑制氧化应激对DCBQ暴露所致分化中SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。4.DCBQ可诱导SH-SY5Y细胞激活线粒体凋亡通路,抑制氧化应激可下调该通路关键因子的表达,提示氧化应激介导的线粒体凋亡通路的激活是DCBQ神经毒性作用的重要分子机制之一。5.DCBQ可抑制SH-SY5Y细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制氧化应激可上调该通路关键基因的表达,提示氧化应激介导的PI3K/AKminimal hepatic encephalopathyT/mTOR信号通路的下调在DCBQ影响神经分化的过程中可能发挥着重要的作用。第三部分PI3K/AKT/mTOR信号通路在DCBQ影响神经分化中的作用及机制目的:本部分研究检测了母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠4周龄和8周龄大脑皮层中PI3K/AKT/mTOR通路关键因子的变化;并选用神经分化中的SH-SY5Y细胞为细胞模型,应用PI3K通路特异性抑制剂LY294002,观察抑制PI3K信号通路后,DCBQ对神经分化中的SH-SY5Y细胞的增殖、分化、氧化应激和凋亡的影响,深入了解PI3K/AKT/mTOR信号通路在DCBQ神经毒性中的作用及可能的机制。方法:1.体内实验实验分组与DCBQ染毒同第一部分。实时定量PCR检测子鼠大脑皮层组织中线粒体凋亡通路关键基因PI3K、AKT和mTOR的mRNA表达水平;Western-Blot检测大脑皮层组织中PI3K、AKT和mRNA蛋白表达水平。2.体外实验本部分实验中仍选择浓度13.5μM作为DCBQ的染毒剂量。实验分为:阴性对照组(Control)、LY294002组(LY组)、DCBQ组和LY294002+DCBQ组(LY+DCBQ组)。细胞增殖、β-Tubulin的蛋白表达水平、ROS生成、线粒体膜电位和细胞凋亡率的检测方法同第一部分。线粒体凋亡通路关键因子Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3的mRNA和蛋白表达水平的测定方法同第二部分。结果:1.母鼠DCBQ暴露后,子代大鼠大脑皮层中的PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白表达水平呈较为显著的下调。2.LY+DCBQ组SH-SY5Y细胞活力与LY组、DCBQ组相比明显降低(P<0.05)。3.LY+DCBQ组细胞β-Tubulin蛋白表达水平较DCBQ组显著降低(P<0.05)。4.与DCBQ暴露组相比,LY+DCBQ组细胞内ROS含量显著升高(P<0.05)。5.LY+DCBQ组细胞的线粒体膜电位,较DCBQ组进一步降低(P<0.05)。6.与DCBQ暴露组相比,LY+DCBQ组早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡细胞百分比均显著升高(P<0.05)。7.LY+DCBQ组细胞内Cyt-C、Caspase 9和Caspase 3的mRNA及蛋白表达水平均显著高于DCBQ组,且远高于LY组,差异具统计学意义(P<0.05)。结论:1.母鼠DCBQ暴露可影响子代大鼠大脑皮层中PI3K/AKT/mTOR通路关键基因mRNA和蛋白的表达。2.抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,强化了DCBQ对神经分化中的SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用。3.抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可进一步强化DCBQ降低SH-SY5Y细胞神经分化的水平。4.抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路进一步促使DCBQ诱导SH-SY5Y细胞ROS的生成,线粒体膜电位下降和细胞凋亡率升高。5.抑制PI3K信号通路后,DCBQ诱导细胞线粒体凋亡通路中关键基因的表达水平进一步升高,PI3K/AKT/mTOR通路在DCBQ所致神经毒性作用中发挥重要作用。