目的:本实验采用DSS法复制小鼠溃疡性结肠炎模型,在评价黄芪多糖对结肠炎疗效的同时,观察小鼠结肠中JAK/STAT信号通路相关蛋白和外周血中Treg/Th17细胞平衡的变medicinal leech化,探明黄芪多糖能否通过干预JAK/STAT信号通路调节Treg/Th17细胞平衡,恢复肠道免疫稳态从而治疗溃疡性结肠炎。方法:1.DSS诱导的溃疡性结肠炎模型复制与给药治疗:60只健康的雄性Balb/c小鼠按照随机数字表法划分为正常组(Control)、模型组(DSS)、黄芪多糖低剂量组(APS-L)、黄芪多糖中剂量组(APS-M)、黄芪多糖高剂量组(APS-H)、美沙拉嗪阳性对照组(5-ASA),每组10只。用无菌水配制3%(w/v)DSS(36 000-selleck产品50 000 k D)溶液。除正常组,其余五组小鼠连续7 d自由饮用3%DSS溶液,此期间正常组自由饮用蒸馏水。以小鼠首次饮用3%DSS为第一天,第5 d开始APS-L组小鼠给予50 mg/kg黄芪多糖灌胃,APS-M组小鼠给予100 mg/kg黄芪多糖灌胃,APS-H组小鼠给予200 mg/kg黄芪多糖灌胃,5-ASA组小鼠给予300 mg/kg美沙拉嗪灌胃,正常组和DSS组小鼠则给予等容积生理盐水灌胃,每日一次,整个给药时间为5 d。另取40只健康的雄性Balb/c小鼠按照随机数字表法划分为正常组(Control)、模型组(DSS)、黄芪多糖组(DSS+APS)、美沙拉嗪阳性对照组(DSS+5-ASA)。除去正常组,另外3组小鼠先连续7 d给予3%DSS溶液饮用以建立急性溃疡性结肠炎小鼠模型。造模结束后第1 d,DSS+APS组小鼠予以200 mg/kg APS混悬液灌胃,DSS+5-ASA组小鼠予以300 mg/kg美沙拉嗪混悬液灌胃,正常组和DSS组都给予等容积生理盐水灌胃,1次/d,连续给药5 d。2.黄芪多糖治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎模型疗效评估:每日在固定时间记录小鼠的体重,并查看小鼠的精神状态、进食量、皮毛光滑程度、活跃程度、便血和粪便的粘滞程度。停止给药后,处死当天测量各组小鼠的体质量、结肠质量、结肠长度,计算肠重指数、单位结肠质量,并在结肠镜下对结肠组织进行病理损伤评分。3.Treg细胞、Th17细胞及相关细胞的分析:运用流式细胞术测定CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-1~+CD4~+CD25~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+、PD-1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+、P D-L1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+以及CD4~+CD44~+IL-17A~+细胞的比率,明确黄芪多糖对结肠炎小鼠Treg/Th17细胞平衡的调控作用。4.JAK/STAT信号通路相关蛋白检测:运用Western blotting法测定小鼠结肠中酪氨酸激酶蛋白1、3(JAK1、JAK3)、信号转导及转录激活蛋白5(STAT5)、磷酸化信号转导及转录激活蛋白5(p-STAT5)、活化STAT蛋白质抑制因子3(PIAS3)、细胞信号传导抑制剂1(SOCS1)、窖蛋白1(Cav-1)、蛋白磷酸酶2(PP2A)的表达情况,探明黄芪多糖对结肠炎小鼠结肠粘膜JAK/STAT信号通路的调控作用。5.统计学分析:运用Graph Pad Prism 9.0统计软件进行数据统计分析,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。组间对比采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05表示统计具有显著性差异,以P<0.01表示统计具有极显著性差异。结果:1.黄芪多糖治疗UC作用机制研究的有效剂量评估:与正常组相比,DSS组小鼠的体质量、结肠长度显著下降(P<0.01),结肠质量、单位结肠质量、肠重指数显著升高(P<0.01),提示造模成功。与DSS组相比,经黄芪多糖干预后,仅APS-H组小鼠体质量显著升高,肠重指数明显下降并具有统计学意义(P<0.01),APS-M组和APS-H组小鼠结肠质量、单位结肠质量显著下降(P<0.05,P<0.01),结肠长度显著上升(P<0.05)。虽然黄芪多糖中、高剂量组各项指标两组间无统计学差异,但是APS-H组结肠质量下降趋势明显低于其他各组,且仅APS-H组明显改善小鼠体质量和肠重指数,并具有极显著性差异。此处实验结果提示黄芪多糖可以有效治疗小鼠UC且高剂量效果最佳。2.高剂量黄芪多糖再次治疗UC小鼠的验证性疗效评价:与正常组比较,DSS组小鼠的体质量显著下降,结肠长度明显变短,肠重指数、疾病活动指数(DAI)评分和组织损伤评分显著升高(P<0.01,P<0.05),提示造模成功。与DSS组相比,经黄芪多糖与美沙拉嗪干预后,治疗组小鼠体质量有所恢复,肠重指数、DAI评分显著下降(P<0.01,P<0.05),同时结肠炎小鼠粘膜较完整,杯状细胞和隐窝大部分开始恢复,腺体排列更有序,血管增生程度变小,溃疡面积减少,炎细胞浸润得到改善,病理学损伤评分明显降低(P<0.01)。与DSS组相比,DSS+APS组结肠长度显著增加(P<0.05)。以上结果分析表明,黄芪多糖可以有效缓解UC。3.Treg细胞、Th17细胞及相关细胞的变化:与正常组比较,DSS组小鼠外周血中PD-1~+CD4~+CD25~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+、CD4~+CD44~+IL-17A~+细胞比率显著上升(P<0.01,P<0.05),CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞比率显著下降(P<0.01,P<0.05);与DSS组相比,治疗组小鼠外周血中PD-1~+CD4~+CD25~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+、CD4~+CD44~+IL-17A~+细胞比率显著下降(P<0.01,P<0.05),DSS+APS组小鼠外周血中CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞比率显著上升(P<0.01,P<0.05),DSS+5-ASA组小鼠外周血中CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~+Foxp3~+、PD-L1~+CD4~+CD25~+Fox p3~+细胞比率显著上升(P<0.01)。上述实验结果表明黄芪多糖可以有效调节Treg/Th17细胞平衡。4.JAK/STAT信号通路相关蛋白的变化:与正常组比较,DSS组小鼠结肠组织中JAK1、JAK3、STAT5、p-STAT5和PP2A的蛋白表达量明显上升(P<0.01),PIAS3、SCOS-1和Caveo Lin-1的蛋白表达量明显下降(P<0.01);与DSS组比较,DSS+APS组小鼠结肠组织中JAK1、STAT5、p-STAT5和PP2A蛋白表达量显著下降(P<0.05,P<0.01),JAK3、PIAS3、SCOS-1和Caveo Lin-1蛋白表达量显著上升(P<0.01);与DSS组比较,DSS+5-ASA组小鼠结肠组织中STAT5、p-STAT5蛋白表达量明显下降(P<0.05,P<0.01),PIAS3、SCOS-1蛋白表达量显著上升(P<0.05)。上述实验结果表明黄芪多糖可以有效调控JAK/STAT信号通路。结论:黄芪多糖有效治疗DSS诱导的点击此处溃疡性结肠炎,这可能是通过抑制JAK/STAT信号通路调节Treg/Th17细胞平衡来实现的。