研究目的:肥胖症的患病率逐年上升,已成为全球重大公共卫生问题。肥胖症(Obesity)是一种表现为脂肪组织蓄积和体重增加的慢性代谢性疾病。脂肪组织分为白色脂肪组织(White adipose tissues,WAT)和棕色脂肪组织(Brown adipose tissues,BAT),WAT以甘油三酯的形式储存能量,而BAT富含线粒体,可以通过特异性解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1,UCP1)以产热的方式消耗能量,从而减轻体重并改善代谢,所以增加人体BAT活性是防治肥胖的有效途径。成人体内经典的棕色脂肪细胞含量极少,但WAT中的某些细胞在寒冷、交感刺激等条件下可表现出棕色脂肪细胞的特点,这类细胞被定义为“米色脂肪细胞”,这一过程被定义为“脂肪组织棕色化”。鸢尾素(Irisin)是运动刺激骨骼肌分泌的一种肌源性细胞因子,能够促进动物及人体脂肪组织棕色化,提高BAT活性,但irisin作用于人体脂肪细胞的受体和受体后信号通路仍未明确。本研究旨在阐明介导irisin促进脂肪细胞米色化作用的受体和受体后关键信号通路,为通过促进脂肪组织棕色化防治肥胖症提供药物干预靶点。研究方法:(1)利用CRISPR-Cas9慢病此网站毒载体构建integrinαV/β1/β5/β6基因敲除的3T3-L1脂肪细胞。首先评估慢病毒感染Cas9空载体对3T3-L1脂肪细胞成脂分化的影响,包括油红O染色观察脂滴形态,实时定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测脂肪合成、分化相关基因(Adipoq、Fabp4、Ppary、Retn)的表达情况。使用Lenti-Cas9-puro感染3T3-L1Peptide Synthesis细胞并经过嘌呤霉素筛选得到3T3-L1-Cas9细胞,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测Flag蛋白表达。设计合成integrinαV/β1/β5/β6 特异性基因敲除 sgRNA 序列,使用 Lenti-sgRNA-EGFP 感染 3T3-L1-Cas9细胞获得integrin αV/β1/β5/β6-KO细胞并验证sgRNA活性和基因敲除效果。(2)构建integrin αV和β1/β5/β6双亚基基因敲除3T3-L1细胞并进行成脂诱导分化,评估irisin干预对各组基因敲除脂肪细胞成脂分化的影响,包括油红O染色观察获悉更多脂滴形态,qRT-PCR检测Adipoq、Fabp4、Pparγ、Retn和Ucp1的表达。(3)应用高分辨率液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测差异表达蛋白质和磷酸化蛋白质。采用火山图和主成分分析(Principal component analysis,PCA)等统计学方法分析差异表达蛋白质及磷酸化肽段的组内及组间数据差异性,根据基因本体(Gene ontology,GO)与京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集差异结果,筛选出介导 irisin促进脂肪细胞米色化效应的磷酸化事件和信号通路。(4)选择基于组学数据得出的PI3K-AKT信号通路进行功能研究及通路验证。利用人体皮下脂肪细胞评估irisin干预对成熟脂肪细胞UCP1蛋白水平和PI3K-AKT通路蛋白质磷酸化水平的影响;在irisin干预前用integrin αVβ5抑制剂(Cyclo RGDyK)预处理脂肪细胞,分析比较抑制剂对脂肪细胞UCP1表达和PI3K-AKT通路蛋白质磷酸化水平的影响,进一步验证介导irisin促进脂肪细胞米色化效应的受体及受体后信号通路。实验结果:(1)3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化为成熟脂肪细胞,油红O染色显示经慢病毒感染Cas9空载体的3T3-L1脂肪细胞(3T3-L1-Cas9-NC)脂滴大小及形态与对照组无显著差异;qRT-PCR分析数据显示3T3-L1-Cas9-NC组脂肪细胞经诱导分化后Adipoq、Fabp4、Ppary、Retn基因水平显著上调(P<0.0001),证实慢病毒感染Cas9空载体不影响脂肪细胞成脂分化。脂肪细胞感染Lenti-Cas9-puro后应用嘌呤霉素筛选阳性感染细胞,与对照组相比,3T3-L1-Cas9细胞状态良好,且WB检测到Flag蛋白条带,证明Cas9稳定株构建成功。依次感染携带integrin αV/β1/β5/β6目的基因敲除序列的Lenti-sgRNA-EGFP,荧光显微镜观察各组荧光阳性细胞数目均达80%以上,表明感染有效。应用基因敲除和突变检测试剂盒检测sgRNA活性,酶切PCR结果显示各组细胞预期位置出现切割条带。WB结果显示相应的敲除靶点蛋白(integrin αV、integrin β1、integrin β5和integrin β6)表达下降,表明目的基因敲除有效。综合两种检测结果筛选出高效敲除的sgRNA序列用于后续实验。(2)利用CRISPR-Cas9慢病毒载体构建integrinαV和β1/β5/β6双亚基基因敲除的3T3-L1细胞系,油红O染色显示三组细胞脂滴形态均有改变,但integrin αVβ5-KO组变化最显著,其脂肪细胞脂滴大小及数目较integrin-NC组显著下调。PCR结果显示irisin促进了 3T3-L1脂肪细胞Ucp1基因表达,但integrinαVβ5-KO组脂肪细胞Adipoq、Fabp4、Pparγ、Retn和Ucp1等成脂分化基因表达水平显著降低(P<0.05),最终选择integrin αVβ5-KO组细胞进行蛋白组学分析,以寻找irisin作用的受体后信号通路。(3)LC-MS/MS分析鉴定出irisin干预后integrin αVβ5-KO和integrin-NC两组脂肪细胞4443个蛋白质和2595个蛋白质磷酸化事件。火山图显示两组差异表达的蛋白质,其中显著上调90个,下调180个;而在差异表达的磷酸化肽段中,显著上调34个,下调159个。PCA结果提示integrin αVβ5-KO和integrin-NC两组数据组内重复性较好,组间变异度较高。磷酸化蛋白质GO富集结果显示,MAPK活性的失活、细胞粘附的负调控和胰岛素受体信号通路等过程显著富集。KEGG富集结果显示integrin αVβ5基因敲除主要引起胰岛素信号通路、脂代谢相关通路及PI3K-AKT通路显著变化。(4)选择PI3K-AKT信号通路并应用人体脂肪细胞进行通路验证。WB结果显示,irisin(40 nM)干预可以显著提高人体皮下成熟脂肪细胞UCP1蛋白水平(P<0.001);在irisin干预脂肪细胞后PI3K、AKT蛋白质磷酸化水平显著升高(P<0.05),但应用cyclo RGDyK(10μM)预处理可以逆转上述改变(P<0.01)。结论:本研究应用CRISPR-Cas9慢病毒载体技术成功构建了 integrin双亚基基因敲除的3T3-L1脂肪细胞,基于LC-MS/MS的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学联合分析数据,结合人体脂肪细胞功能学验证和信号通路验证结果,初次证实irisin通过integrinαVβ5促进人体脂肪细胞米色化,PI3K-AKT信号通路可能是相关调控机制,可以为通过促进脂肪组织棕色化干预肥胖症和代谢病提供新的药物研发靶点。