猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病原菌,具有高发病率和高致死率的特点,给养猪业的疫病防控带来了巨大的挑战。随着细菌对传统抗生素耐药性的增加,迫切需要开发抗生素的替代药物或增效剂来提高抗菌效率。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMPs)是一类具有抗菌活性和免疫调节活性的小分子多肽,在细菌、真菌、植物和动物体内广泛表达。由于抗菌肽独特的杀菌机制使其不易产生耐药性,有望被开发为新一代抗菌和免疫调节药物。因此,本研究检测了鸡源AMPs(CATH-1、-2、-3和-B1)、鼠源AMPs(CRAMP)和猪源AMPs(PMAP-36和PR-39)对SS2的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC),结果表明CATH-1的抗菌效果优于所检测的其他AMPs。然而,CATH-1在SS2感染中发挥的作用尚不清楚,因此我们通过体外和体内实验探究了CATH-1在SS2感染过程中的抗菌和抗炎作用。首先,在体外通过时间-杀菌曲线测定以及扫描电镜和透射电镜观察,发现CATH-1能够在短时间内快速破坏细菌细胞膜的完整性,改变细菌的超微结构,导致菌体裂解。其次,CATH-1的体内治疗效果显示,CATH-1可以提高感染SS2的小鼠存活率,并显著降低肺脏、肝脏、脾脏、血液和腹腔灌洗液中的细菌定殖量,有效biomedical materials降低SS2感染诱导的炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-12和IL-18的释放,减轻SS2对肺脏、肝脏和脾脏的损伤。此外,对CATH-1抗炎作用机制的进一步研究表明,CATH-1可以通过直接杀菌作用减轻炎症反应,并且TLR2/4/NF-κB/ERK通路也参与了CATH-1减轻SS2诱导炎症反应。本研究为AMPs作为新型抗微生物感染药物的研究和开发提供了科学依据。1.CATH-1对猪链球菌2型的体外抗菌活性研究采用微量肉汤稀释法检测多种AMPs对SS2的MIC和MBC。结果显示,CATH-1的抗菌效果优于所检测的其他AMPs。因此进一步对CATH-1的体外抗菌活性进行了探究,首先,时间-杀菌曲线检测结果显示CATH-1的浓度为2×MIC和4×MIC时,在20 min内能够快速有效的对SS2发挥杀菌作用;然后利用扫描电镜和透射电镜观察CATH-1对SS2细菌形态的影响,结果显示,经CATH-1处理后的细菌出现细胞膜损伤破裂、皱缩以及菌体裂解等更多现象,并且细菌的超微结构被破坏,胞浆内电子密度降低,胞浆内容物发生渗漏。这些结果表明,CATH-1可以通过破坏SS2的细胞膜来发挥杀菌作用。2.CATH-1对猪链球菌2型的体内抗菌活性研究首先,将10 mg/kg的CATH-1经腹腔注射到小鼠体内,连续称量小鼠体重7天后,取肺脏、肝脏和脾脏组织进行H&E染色分析,评估CATH-1在小鼠体内的生物安全性。结果显示,CATH-1对小鼠的体重影响较小,并且CATH-1处理组小鼠的肺脏、肝脏和脾脏组织均未出现病理变化。以上结果表明,CATH-1在小鼠体内不存在生物安全问题,提示其可以被开发为抗感染药物。用SS2腹腔感染小鼠,2 h后腹腔注射CATH-1,观察并记录小鼠存活状况;采集小鼠肺脏、肝脏、脾脏、血液以及腹腔灌洗液,检测细菌定殖量;对肺脏、肝脏和脾脏组织进行H&E染色,分析CATH-1是否有助于改善SS2感染引发的组织病理变化。为了探究CATH-1是否能够在体内感染SS2后发挥抗炎作用,使用SS2感染小鼠,经CATH-1治疗后取小鼠腹腔灌洗液,检测其中的炎性细胞因子分泌水平。结果显示:CATH-1可以提高感染SS2的小鼠存活率;CATH-1治疗显著减少了SS2感染小鼠在肺脏、肝脏、脾脏、血液以及腹腔灌洗液中的细菌定殖量;CATH-1治疗使SS2感染导致的肺组织炎性细胞浸润、肝细胞点状坏死和无序的索状排列、脾小结萎缩和边缘面积缺失等现象有所改善;CATH-1治疗后显著降低了SS2感染诱导的炎性细胞因子IL-1β、IL-1α、IL-12和IL-18分泌。以上结果说明,CATH-1对SS2的致命感染有明显的保护作用,在体内对SS2具有直接杀菌作用,能够减轻SS2感染诱导的组织损伤,并且还能够通过免疫调节活性对SS2感染小鼠发挥保护作用。3.CATH-1对猪链球菌2型的抗炎活性研究为探讨宿主感染SS2后CATH-1抑制炎性细胞因子分泌的确切机制,用SS2感染小鼠原代巨噬细胞,在不同时间点加入CATH-1,收集细胞上清,ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平,以及对感染后黏附和侵入细胞的细菌进行量化;用SS2感染WT、TLR2~(-/-)和TLR4~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞,通过ELISA检测炎性细胞因子的分泌水平;在感染前2 h用抗菌肽预处理细胞,Western blot检测TLR2、TLR4、p-p65、p65、p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白水平。结果显示,CATH-1与SS2共孵育(co-incubation),显著减少了SS2感染诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌,以及黏附和侵入细胞的细菌量;然而,SS2感染后孵育CATH-1(post-incubation)Galunisertib研究购买,以庆大霉素(250μg/mL)作为对照,IL-1β和IL-6的分泌量升高,并且细胞内的细菌量也增加。SS2感染前预孵育CATH-1(pre-incubation),显著减少了SS2感染诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌,而不影响黏附和侵入细胞的细菌量;与WT巨噬细胞相比,TLR2~(-/-)和TLR4~(-/-)巨噬细胞中SS2感染诱导的炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平显著降低,并且CATH-1显著抑制了SS2感染的巨噬细胞中TLR2和TLR4的表达;SS2感染60 min和120 min后,p-p65和p-ERK1/2的表达显著上调,而CATH-1预处理细胞后,p-p65和p-ERK1/2的表达被抑制。以上结果表明,CATH-1可以通过直接杀菌作用减轻炎症反应,并且TLR2/4/NF-κB/ERK通路也参与了CATH-1减轻SS2诱导炎症反应。