随着生活水平的不断提高,长期高脂饲喂导致了宠物肥胖数量增多,同时也引发了宠物的各种代谢性疾病。胰岛素是调控能量代谢的关键激素,长期摄入高热量的食物,会导致胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR),最终会引发糖尿病。糖尿病肾病是糖尿病常见而又严重的并发症之一,但实际上,在高胰岛素血症期间,肾小球和肾小管的结构就已经发生病理性的改变。目前大多数研究主要聚焦在糖尿病时期的肾脏损伤的变化,关于IR过程中的肾脏损伤变化情况并没有进行系统的研究。当前动物肥胖的原因是长期摄入高热量食物,因此,我们通过饲喂高脂饲料的方法建立动物IR模型,从肾脏的生化指标、病理组织学、葡萄糖重吸收能力等多角度、多层面观察IR过程中肾脏的损伤变化情况,对肾脏损伤情况做出全面的判断。此外,在以往关于糖尿病肾病的研究中,虽然都有在关注线粒体功能障碍以及缺氧在肾脏损伤中的作用,但是,在IR过程中肾脏的能量代谢方式是否转变、以及整体的代谢规律和特征发生哪些变化等都需要进一步的明确。因此,本研究旨在建立C57BL6小鼠IR模型,并探获悉更多究在发生IR这一过程中,肾脏损伤与能量代谢之间的关系。本实验通过采用饲喂高脂饲料方法诱导C57BL6小鼠肥胖和IR。通过葡萄糖耐受实验以及胰岛素抵抗指数来评估低脂饲喂组(LFD)和高脂饲喂组(HFD)小鼠胰岛素抵抗的发生;通过对血清和尿液进行分析,以评估肾脏功能的变化情况;采用HE、Masson、PAS染色的方法观察肾脏组织状态,以便对肾脏进行病理评估;利用透射电镜观察肾脏足细胞以及线粒体状态;使用Western blot方法检测肾脏中相关蛋白表达情况,包括胰岛素信号通路蛋白、线粒体相关蛋白、自噬蛋白、炎症相关蛋白、纤维化蛋白、衰老以及凋亡蛋白等;通过免疫组化的方式对肾脏葡萄糖重吸收相关蛋白进行评估;通过免疫荧光对肾脏自噬过程中关键蛋白LC3、LAMP2进行评估;Smoothened Agonist体外使用试剂盒检测肾脏ATP含量、线粒体复合物的变化以及乳酸脱氢酶的活力,综合评估肾脏能量状态。实验结果显示:在第6周时,HFD组PAS、Masson染色中观察到,肾小管出现糖原以及胶原纤维的积聚;HFD组肾脏足细胞足突开始出现部分融合;HFD组炎症相关蛋白(IL-6、TNF-α)的表达量显著增多(P<0.001),且随着时间的增加而增加;HFD组的自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、LAMP2)显著低于LFD组(P<0.001),但衰老和凋亡相关蛋白的表达显著升高;线粒体生物发生相关蛋白(AMPK、PGC-1α、SIRT1/3)已经受到显著抑制(P<0.001),且随着时间的增加抑制程度加剧;HFD组的线粒体分裂蛋白(DRP1)显著增加(P<0.001),且随着时间的增加而增加,通过电镜可观察到处于分裂状态的线粒体增多,线粒体融合蛋白(OPA1、MFN2)也显著高于LFD组(P<0.001);肾脏中ATP显著高于LFD组;果糖磷酸激酶活性增强(P<0.05)。第8周时,HFD组小鼠发生胰岛素抵抗;HFD组肾脏糖原以及胶原纤维的积聚增加;HFD组肾脏足细胞足突融合增加,基底膜不均匀,部分基底膜出现增厚现象;HFD组自噬相关蛋白显著低于与LFD组(P<0.001);HFD组线粒体融合蛋白(MFN2、OPA1)依旧显著高于LFD组(P<0.05);通过电镜可观察到,HFD组线粒体多为球形,开始出现肿胀以及嵴结构不清晰线粒体;此外,果糖磷酸激酶和乳酸脱氢酶活性相比于LFD组显著增加(P<0.05);肾脏中ATP含量进一步增多,并显著高于LFD组。第10周时,HFD小鼠肾脏胰岛素通路受到抑制;HFD组肾脏损伤的相关指标(Scr、BUN)出现显著变化(P<0.05);HFD组肾脏糖原以及胶原纤维的积聚增加;HFD组肾脏足细胞足突大量融合,基底膜增厚;HFD组线粒体融合蛋白(MFN2、OPA1)表达量与LFD组相比显著减少(P<0.001);通过电镜可观察到,HTemple medicineFD组肿胀以及嵴结构不清晰线粒体增多;果糖磷酸激酶和乳酸脱氢酶活性进一步增强;肾脏中ATP含量较8周显著下降,但仍高于LFD组。第12周时,HFD组肾小球肿胀、基质沉积明显,肾小管管腔狭窄,上皮细胞出现脱落,肾小管糖原沉积减少,肾小管中出现大量脂质小泡;HFD组肾脏足细胞足突大量融合,部分足细胞出现脱落;肾脏自噬、线粒体生物发生、融合相关蛋白受到严重抑制(P<0.001);通过透射电镜可见肾小管线粒体形态细小,嵴结构模糊,出现大量空泡线粒体;果糖磷酸激酶和乳酸脱氢酶活性更进一步增强,但ATP含量较10周时出现显著下降(P<0.001),但仍不低于LFD组。实验结果表明:高脂饲料会导致C57BL6小鼠发生IR。在IR过程中,肾小球基质沉积增加,炎症反应与凋亡途径增强,血清肌酐等指标发生改变,肾脏出现功能障碍,同时,肾脏细胞自噬降低,细胞衰老增加。在肾脏IR之前,线粒体生物发生降低,但是可以仍然可以通过增强线粒体融合以及通过无氧糖酵解为肾脏提供大量能量;在肾脏IR发生后,线粒体融合降低,线粒体产生的ATP减少,肾脏无氧糖酵解进一步增强。