RepSox生产商新城疫(Newcastle disease,ND)俗称“鸡瘟”,也称之为亚洲鸡瘟,是一种由副粘病毒科ND病毒(ND virus,NDV)引起的高度接触性的烈性传染病,被国际兽医局列为的世界A类疫病。目前,由于养禽业对新城疫疾病的疫苗免疫比较重视,一般情况下不会爆发典型新城疫。但是,由于养殖环境的改变,NDV的基因型在不断进化以及免疫鸡群受到强毒攻击等因素影响。近些年来,在免疫鸡群中发生的新城疫,往往表现出亚临床或非典型症状,发病率始终保持在15%-50%。发生非典型新城疫的不同日龄鸡易受到其他病原菌如大肠杆菌等微生物引起的内源性感染,致使雏鸡生产性能下降,育成鸡死亡率增加,给我国家禽业造成巨大的经济损失。因此,探究有效的方法来提高疫苗的免疫效果仍然具有重要意义。天然产物及其有效成分具有天然温和、安全高效和价格低廉的特点。同时,随着人们对食品安全和绿色健康的重视,应用中药等天然产物及其有效成分增强动物机体免疫已成为近年来的研究热点。本实验室前期研究表明,酵母细胞壁多糖能够通过提高鸡对新城疫疫苗免疫后的HI效价、肠道特异性s Ig A、Ig A+细胞数、脾脏及空肠免疫相关基因相对表达量来增强雏鸡免疫功能。酵母细胞壁多糖主要含有β-葡聚糖和甘露寡糖。因此,本研究拟进一步研究以β-葡聚糖为主要成分的酵母细胞壁多糖(G70)的免疫增强作用。通过体液免疫、细胞免疫和肠道免疫探究酵母β-葡聚糖(G70)对鸡免疫新城疫疫苗的影响,同时利用RNA-seq和RT-q PCR试验探索G70可能的作用机制,旨在为酵母β-葡聚糖(G70)作为免疫增强剂运用到临床以及酵母β-葡聚糖作用机制的理论研究提供参考。本研究包括以下试验研究内容:1.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡体液和细胞免疫的影响试验选取48只1日龄雄性商品乌骨鸡(体重45±5 g)适应性喂养5 d后,按其体况大体一致的原则随机分为3组,H组、C组和S组,每组16只。生理盐水组(S组)和疫苗组(C组)饲喂基础日粮,G70组(H组)在饲喂基础日粮的基础上添加1 g/kg的酵母β-葡聚糖(G70)。分别于14、28日龄通过点眼滴鼻的方式进行ND疫苗进行首次免疫和加强免疫,生理盐水组则免疫相同剂量的生理盐水。试验期间,我们通过测定免疫器官指数,HA-HI法检测血清NDV特异性抗体水平,MTT法检测外周血淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量,RT-q PCR检测脾脏中免疫相关基因,探究G70对鸡体液和细胞免疫的作用。结果显示,酵母β-葡聚糖显著降低鸡法氏囊的器官指数(P<0.05),与免疫对照和生理盐水对照组相比,胸腺和脾脏的器官指数升高,但差异不显著。对于特异性抗体水平,在首次免疫后7 d、14 d(P<0.05)和二次免疫后7 d、14 d,G70组血清NDV特异性抗体水平高于免疫对照组。在二次免疫后7 d,与免疫对照组相比,G70组外周血淋巴细胞刺激指数显著升高(P<0.05)。同时,G70组外周血CD4+/CD8+T细胞比例显著上升(P<0.05)。另外,与疫苗对照组相比,G70组脾脏组织中IL-6(P<0.05)、TGF-β(P<0.01)和TLR5(P<0.05)的m RNA表达水平显著上调,而IFN-γ、TLR4、TLR3以及CD40、CD80和CD86的m RNA表达无显著变化(P>0.05)。2.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡肠道免疫的影响本章实验利用HE染色显微镜下观察肠道绒毛结构,MTT法检测肠道淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测肠道CD4+T细胞和CD8+T细胞数量,RT-q PCR检测空肠中免疫相关基因,进一步探讨酵母β-葡聚糖对鸡肠道免疫的作用。结果显示,酵母β-葡聚糖显著提高隐窝深度(P<0.05)。在二次免疫后1周,G70组肠道淋巴细胞刺激指数显著升高与免疫对照组相比(P<0.05)。同时,G70组肠道CD4+/CD8+T细胞比例显Antibiotic de-escalation著上升(P<0.05)。此外,与疫苗组相比,G70组肠道组织中GATA-3、MHC-I、MHC-II和CCR7的m RNA表达水平显著上调(P<0.05),而IL-6、TGF-β、NF-κB、TLR3、TLR4、TLR5、IFN-γ、CCR7、CCR9、J-chain以及CD40、CD80、CD86的m RNA表达无显著变化(P>0.05)。3.酵母β-葡聚糖(G70)对鸡脾脏基因表达的影响运用转录组测序技术分析脾脏中的相关基因和通路的表达谱差异,以阐明免疫增强作用机制。分别从G70组(H组)和疫苗对照组(C组)中随机选取4只乌骨鸡,收集脾脏做转录组分析,差异表达基因筛选标准为q<0.05。结果显示,H组与C组间共鉴定出198个差异表达基因,其中47个上调,151个下调。GO显著富集分析共有13个GO term,富集的GO term包括体液免疫反应、趋化因子反应、抗菌体液反应、对细菌的防御反应、由抗菌肽介导的对抗菌体液的免疫反应、对革兰氏阴性菌的防御反应、对革兰氏阳性菌的防御反应、线粒体呼吸链复合体I、NADH脱氢酶复合体、呼吸链、CCR趋化因子受体结合、趋化因子受体结合和脂多糖结合。KEGG富集分析中共有7条显著富集的代谢途径,分别为神经活性配体与受体的相互作用、缝隙连接、MAPK信号通路、ABC转运体、氨基酸生物合成、药物代谢和蛋白质的输出。此外,转录组测序结果显示13个DEGs显著富集在MAPK信号通路上。这提示酵母β-葡聚糖可能通过MAPK信号通路调节鸡脾脏的免疫反应。为进一步探究酵母β-葡聚糖的免疫增强作用机制,因此,采用RT-q PCR检测MAPK信号通路相关基因。结果显示,FAS和CACNA2的m RNA表达水平显著降低,MAPK信号通路Rapamycin临床试验其他相关基因表达水平变化不显著。综上所述,在基础日粮中添加0.1%酵母β-葡聚糖可显著提高新城疫疫苗免疫后鸡血清特异性抗体HI滴度、外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值和肠道的CD4+CD8+T细胞比例、促进外周血和肠道淋巴细胞增殖能力以及调节肠道和脾脏免疫相关基因的m RNA水平。此外,脾脏转录组共筛选出198个差异表达基因,差异基因共富集到13个GO term,7条KEGG代谢途径。提示酵母β-葡聚糖(G70)的免疫增强作用可能与上调脾脏中G-蛋白偶联5-HT受体和MHC类多肽相关的m RNA表达,抑制MAPK信号通路中的FAS和CACNA2基因相关。另外,有趣的是酵母β-葡聚糖能够显著下调抗菌肽和禽β-防御素等相关m RNA的表达。