目的:TRPV1(瞬时受体电位香草酸1)通道作为非选择性阳离子通道,能够被配体、酸、高热和动物毒素等多种有害刺激激活。TRPV1在有害信息传入神经元上具有广泛分布,因此是感知和调节疼痛的重要受体。前期研究发现,抑制TRPV1通道能达到镇痛的效果。因此,靶向TRPV1通道的新型镇痛剂研发一度成为多家跨国制药公司的研究热点。但是,在TRPV1通道调节剂的开发过程中,研究人员发现抑制剂存在升高哺乳动物或人体体温的副作用,这使得许多的先导分子在临床试验阶段以失败告终。这也是TRPV1通道调节剂研究停滞不前的重要原因之一。近期的研究发现,TRPV1对不同刺激的反应通路不同,提示在不干扰温度感受功能的前提下,有可能通过选择性地抑制TRPV1通道与配体的结合而实现镇痛。虽然TRPV1与其特异性激动剂辣椒素的结合方式和分子间相互作用已被揭示,但已有TRPV1通道抑制剂与TRPV1的结合的分子机制仍未阐明。因此,我们选择了与辣椒素结构类似、影响哺乳动物体温的TRPVINCB28060 MW1抑制剂AMG9810为代表性工具分子,对其与TRPV1通道相互作用的分子机制进行了研究,基于这些机制对AMG9810进行理性的结构优化并对结构改造化合物进行功能验证,最终获得专一抑制配体激活且对体温影响较小的高效先导分子。本课题的开展将为靶向TRPV1的新型镇痛药物提供可靠的理论指导。方法:首先,利用分子对接软件模拟AMG9810与TRPV1通道的结合方式,并预测其与对接口袋中可能发生氢键相互作用的关键残基,接着利用分子生物学手段根据预测结果将关键氨基酸残基进行单点或双点突变。将人源、鼠源野生型以及突变体质粒转染至HEK293T细胞上,利用膜片钳技术采用全细胞、内面向外模式记录AMG9810抑制不同激动剂激活人源、鼠源野生型TRPV1通道的过程,从而确定AMG9810与TRPV1通道的结合模式。最后,我们对AMG9810进行了结构改造,并评价结构改造化合物对TRPV1通道的调节作用。结果:1.AMG9810浓度依赖性地抑制辣椒素对鼠源TRPV1通道的激活,其IC_(50)值为1.65±0.56μM(n=3)。2.AMG9810抑制内源性激动剂AEA激活鼠源野生型TRPV1、突变体T551V和S513A的全细胞膜片钳结果显示,AMG9810抑制野生型TRPV1的IC_(50)为0.53±0.03μM(n=3),突变体T551V的IC_(50)值为8.food microbiology65±2.78μM(n=3),突变体S513A的IC_(50)值为1.52±0.33μM(n=3)。与野生型相比,AMG9810抑制突变体T55selleck合成1V和S513A的IC_(50)值发生明显右移,而相对于S513A,T551V显示出更显著的IC_(50)值的增加。3.AMG9810抑制非选择性TRPV1激动剂2-APB激活鼠源野生型TRPV1、突变体S513A、T551V、Y512A以及双突变T551V-Y512A的全细胞膜片钳结果显示,AMG9810抑制野生型TRPV1的IC_(50)值为0.05±0.01μM(n=3);S513A的IC_(50)值为0.07±0.01μM(n=4);相对于野生型TRPV1,突变体S513A的IC_(50)值并未发生明显右移。突变体Y512A的IC_(50)值大于1μM(n=3);突变体T551V和双突变体T551V-Y512A的IC_(50)值均大于100μM(n=3)。与野生型和突变体S513A相比,AMG9810抑制突变体T551V、Y512A和双突变体T551V-Y512A的IC_(50)值均发生显著右移。4.AMG9810抑制p H激活鼠源野生型TRPV1、突变体S513A、T551V、Y512A以及双突变体T551V-Y512A的全细胞膜片钳结果显示,AMG9810抑制野生型TRPV1的IC_(50)值为1.42±0.04μM(n=6);S513A的IC_(50)值为2.31±0.24μM(n=3);突变体T551V、Y512A和双突变体T551V-Y512A的IC_(50)值均大于150μM(n=3-4)。相对于野生型TRPV1和突变体S513A,T551V、Y512A和双突变体T551V-Y512A的IC_(50)值均发生显著右移。5.针对温度激活研究,首先我们利用2-APB通过降低野生型TRPV1温度阈值的策略使整个系统的温度记录结果左移,这样便于观察AMG9810抑制温度激活的整个过程。AMG9810抑制2-APB协同温度激活人源野生型TRPV1、突变体S512A、Y511A以及T550V的内向外膜片钳记录显示,2-APB激活野生型TRPV1的热激活阈值显著左移,为31.1±1.8℃(n=5);低浓度AMG9810抑制2-APB协同温度激活野生型TRPV1的热激活阈值为37.7±2.1℃(n=9);高浓度的热激活阈值为38.1±2.1℃(n=9);AMG9810抑制2-APB协同温度激活突变体S512A的热激活阈值为37.4±1.6℃(n=6);突变体T550V的热激活阈值为33.5±1.9℃(n=4),突变体Y511A的热激活阈值为43.2±0.9℃(n=5)。相对于野生型TRPV1和突变体S512A,AMG9810抑制2-APB协同温度激活突变体T550V、Y511A的热激活阈值发生了显著性变化。6.AMG9810的结构改造化合物AMG9810-1、AMG9810-2与AMG9810相比,抑制激动剂激活TRPV1的IC_(50)值并没有显示出明显变化。AMG9810-3抑制TRPV1通道激活的效果明显高于AMG9810。结论:1.与辣椒素和AEA相同,AMG9810与TRPV1通道的香草素结合口袋(vanilloid binding pocket,VBP)结合,发挥其对配体激活的抑制作用。2.在VBP中,AMG9810可能采取两种不同的方式与TRPV1通道的口袋结合,分别为(1)“头朝上,尾朝下”的结合方式:通过“颈部”与S4片段中的残基T551形成氢键作用结合在VBP中;(2)“头朝下,尾朝上”的结合方式:通过“头部”与残基S513、“颈部”与Y512形成氢键的相互作用。3.AMG9810通过与TRPV1的氨基酸T551或Y512/S513结合不但抑制激动剂对通道的激活作用,而且还影响通道的氢离子激活及温度激活,因此并不是TRPV1通道的竞争性拮抗剂。4.AMG9810“头部”和“颈部”的结构修饰相对于“尾部”并没有使其配体活性发生显著改变,说明“尾部”的改造对体温副作用小的调节剂开发有一定的理论指导意义。