帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大神经退行性疾病,其主要临床症状表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势不稳等。越来越多的研究证实,脑铁代谢异常导致的铁沉积是PD黑质区多巴胺能神经元退变的重要因素。溶酶体是细胞内重要的储铁细胞器,由于其酸性和还原性环境,溶酶体内的铁通常以还原型的二价铁形式存在。当溶酶体膜被破坏时,大量的二价铁释放至胞浆则会引发Fenton反应而造成细胞死亡。转录因子EB(transcription FactoMirdametinib细胞培养r EB,TFEB)是调节溶酶体再生和自噬的重要因子,已有研究证实,高表达TFEB能够改善溶酶体功能,从而在PD中发挥神经保护作用,是防治PD的有效策略之一。现有的研究主要集中在TFEB调节溶酶体再生和清除病理性蛋白积聚,而TFEB能否调节铁代谢相关蛋白进而影响铁死亡,尚不清楚。目的:本课题将探讨TFEB调节铁代谢相关蛋白以及抑制铁死亡的作用和可能机制。方法:采用脑立体定位技术将携带有tfeb的腺相关病毒(adeno-associated virus carried TFEB,AAV-TFEB)注射至C57BL/6小鼠黑质区,构建黑质区高表达TFEB的小鼠模型(Vehicle小鼠和AAV-TFEB小鼠)。采用旷场实验、爬杆试验和转棒实验评估模型小鼠的运动功能。采用冰冻切片、免疫荧光染色和免疫印迹等方法,检测溶酶体再生和铁代谢相关蛋白的变化。采用携带有tfeb的慢病毒转染PC12细胞,构建高表达TFEB的PC12细胞模型(Lv-GFP细胞和Lv-TFEB细胞)。在上述模型中,分别给予铁死亡诱导剂(Erastin)或枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理,构建铁死亡细胞模型。采用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate)探针结合荧光显微镜的方法检测细胞内活性氧水平变化。采用免疫印迹检测铁代谢和铁死亡相关蛋白的变化。铁超载条件下,采用细胞膜片钳技术检测高表达TFEB对细胞膜电位的影响。在PC12细胞上,采用si RNA和免疫印迹相结合的方法,检测敲低TFEB后铁死亡相关蛋白的变化。结果:1.小鼠黑质区高表达TFEB能够促进溶酶体再生。与Vehicle组小鼠相比,AAV-TFEB组小鼠黑质区溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)和组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的蛋白水平显著升高,提示在小鼠黑质区高表达TFEB后能够促进溶酶体再生并且增强其降解能力。2.黑质区高表达TFEB可增强小鼠的运动能力。在旷场实验中,与Vehicle组小鼠相比,AAV-TFEB组小鼠的持续运动总距离显著增加,但是两组小鼠在中央区域停留的时间无明显差异,提示黑质区高表达TFEB可增强小鼠的持续运动能力,但不会出现焦虑样行为。在爬杆实验和转棒实验中,两组小鼠爬杆所需要的总时间以及在转棒上停留的时间均无明显差异,提示黑质区高表达TFEB对小鼠的运动协调能力无显著影响。3.黑质区高表达TFEB对铁代谢相关蛋白的影响。(1)与Vehicle组小鼠相比,AAV-TFEB组小鼠黑质区转铁蛋白受体1(transferrin receptor,TfR1)的蛋白水平显著升高,而二价金属离子转运体(divalent metal transporter1,DMT1)的蛋白水平无明显变化,提示黑质区高表达TFEB后可能增加了细胞和溶酶体的摄铁能力,但是不影响溶酶体内铁的转出。(2)与Vehicle组相比,AAV-TFEB组小鼠黑质区铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)的蛋白水平显著升高,提示黑质区高表达TFEB可能增强了细胞的储铁能力。4.高表达TFEB不影响铁自噬选择性受体–核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)的蛋白水平。在小鼠黑质区高表达TFEB或者在PC12细胞上高表达TFEB后,铁自噬的选择性受体NCOA4的蛋白水平均无明显变化,提示高表达TFEB可能不影响NCOA4介导的铁自噬。5.TFEB在铁死亡中的作用及机制。(1)构建高表达TFEB的PC12细胞(无荧光),给予铁死亡诱导剂Erastin(10μM)处理24小时后,与Lv-Flag组细胞相比,Lv-TFEB组细胞的LDH水平显著降低,提示高表达TFEB可缓解Erastin诱发的细胞毒性。(2)在高表达TFEB的PC12细胞上,给予铁死亡诱导剂Erastin(10μM)处理24小时后,与Lv-GFP组细胞相比,Lv-TFEB组细胞的TfR1蛋白水平显著升高,而两组细胞的DMT1蛋白水平无显著变化,提示在Erastin诱发铁死亡的细胞模型中,高表达TFEB可能仍然具有增强溶酶体铁储存的能力。(3)在高表达TFEB的PC12细胞上,给予FAC(100μM)处理24小时后,Lv-GFP和Lv-TFEB细胞的TfR1蛋白水平均显著下降,但是,与Lv-GFP+FAC组细胞相比,Lv-TFEB+FAC组细胞的TfR1蛋白水平仍然显著增高biotic index,提示在铁超载环境下,高表达TFEB可减缓TfR1蛋白水平下降。(4)在高表达TFEB的PC12细胞上,分别给予Erastin和FAC处理24小时,铁自噬选择性受体NCOA4的蛋白水平均无显著变化,提示在上述两种细胞模型中,高表达TFEB可能不影响NCOA4介导的铁自噬。(5)在电流模式下,Lv-GFP和Lv-TFEB细胞均无自发和诱导放电,记录的5个细胞平均静息膜电位分别为-19.39 mV(Lv-GFP细胞)和-21.06 mV(Lv-TFEB细胞)。灌流液加入FAC(100μM)后,Lv-GFP细胞的膜电位显著降低到-28.53 mV,但是Lv-TFEB细胞的膜电位无显著变化,提示高表达TFEB可维持细胞的电活动不受铁超载影响。(6)在高表达TFEB的PC12细胞(无荧光),给予铁死亡诱导剂Erastin(10μM)处理24小时后,与Lv-TFEB组细胞相比,Lv-Flag组细胞的ROS水平显著升高,提示高表达TFEB可缓解Erastin诱发的ROS水平升高。(7)与Vehicle组小鼠相比,AAV-TFEB组小鼠黑质区xCT和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的蛋白水平均显著升高。同时,在PC12细胞中,高表达TFEB后GPX4的蛋白水平显著升高,而敲低TFEB后,GPX4的蛋白水平则显著下降。以上提示,TFEB可能通NVP-TNKS656试剂过调节xCT-GPX4通路而抑制铁死亡。结论:综上所述,黑质区高表达TFEB可增强小鼠的持续运动能力,上调铁代谢相关蛋白TfR1、FTL和FTH的蛋白水平,但是不影响铁自噬选择性受体NCOA4的蛋白水平。在PC12细胞上,TFEB可能通过(1)调节TfR1而增加溶酶体的储铁能力,稳定细胞膜电位,(2)调节xCT-GPX4通路,降低细胞内ROS水平,从减少铁离子聚集和脂质过氧化物累积两方面而抑制铁死亡。本课题的研究为丰富TFEB功能提供了理论依据,为防治PD提供了新视角和新策略。