研究目的研究采用博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型,观察血栓通注射液对大鼠模型的药效学作用,并基于整体动物和细胞实验对其药效机制进行探索性研究。本课题的研究为血栓通注射液临床应用以及治疗肺纤维化药物的开发提供理论依据和实验基础。研究方法1血栓LGX818通注射液对博来霉素所致肺纤维化大鼠的药效学研究气管内注射博来霉素(5 mg·kg-1)对Wistar大鼠造模。按照体质量随机分为假手术组、模型组、吡非尼酮组(50 mg·kg-1)、血栓通注射液低、中和高剂量组(27、54、81 mg·kg-1),假手术组和模型组均给予等体积的生理盐水。每日一次,连续给药7 d、14 d、28 d,观察大鼠一般生存状态和体质量,进行以下指标检测:①肺系数,②肺功能指标,③肺部影像学,④并进行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)和 Masson 染色(masson staining,Masson)观察肺组织病理学,⑤采用酶https://www.selleck.cn/products/dinaciclib-sch727965.html联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定大鼠肺组织中Ⅰ型胶原(collagen I,COL-I)和纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的表达水平,⑥免疫荧光法测定α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和COL-I表达水平,⑦免疫印迹试验法(western blot,WB)测定各组大鼠肺组织中α-SMA、COL-I、波形蛋白(Vimentin,Vim)和 E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达水平。采用ELISA测定大鼠肺组织中凝血相关因子凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)、可溶性纤维蛋白单体复合物(soluble fibrin monomer complex,SFMC)和血浆凝血酶原片段(prothrombin fragment 1+2,F1+2)含量。2血栓通注射液药效机制探索研究采用凝血酶(thrombin,THR)与不同浓度的三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)共培养MRC-5细胞,采用细胞计数试剂盒法(cell counting kit-8,CCK-8)筛选的适宜浓度及给药时长,利用高内涵分析技术检测其对细胞数目的影响。采用RT-PCR和Western Blot法测定细胞中的α-SMA、Vimentin和E-cad变化水平;采用RT-PCR和Western Blot法测定细胞中的PAR-1表达水平;采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰技术,沉默PAR-1后,用血栓通注射液有效成分三七总皂苷进行干预,RT-PCR和Western Blot法测定细胞中的α-SMA、Vimentin和E-cad变化水平,观察上述蛋白水平的变化,验证所得结果。研究结果1血栓通注射液对博来霉素所致肺纤维化大鼠的药效学研究一般状况:假手术组大鼠精神状态良好,好动活跃,体质量持续正常增长。模型组大鼠精神萎靡,毛色暗淡。血栓通注射液低、中和高剂量组的大鼠整体生存状态优于模型组。比较各组体质量发现,与模型组比较,在7、14、21和28 d的结果中,吡非尼酮组和血栓通注射液低、中和高剂量组的大鼠体质量均显著高于模型组。肺系数:与假手术组比较,模型组大鼠肺系数显著升高,与模型组比较,在7、14和28 d的结果中,吡非尼酮组和血栓通注射液低、中和高剂量组大鼠肺系数显著下降。肺功能:与假手术组比较,模型组大鼠的各项肺功能指标已经出现了较为明显的改变,主要表现为潮气量显著下降,气道阻力显著升高,动态肺顺应性显著降低。与模型组比较,在7、14和28 d的结果中,吡非尼酮组和血栓通注射液中和高剂量组均能上调潮气量,降低气道阻力,上调动态肺顺应性,同时比较三个时间点,7 d的结果显著优于14 d和28 d的结果。肺部影像学:假手术组大鼠肺部CT未见异常,肺部纹理清晰,透过度均匀,没有异常纹路和片状阴影。模型组大鼠肺部纹理紊乱较多,透过度不均匀,有致密阴影,边界模糊。与模型组相比,吡非尼酮组和血栓通注射液组肺部纹理清晰度有显著改善,透过度均匀,致密阴影较少,没有异常纹路及阴影。肺组织病理学:观察各组大鼠肺组织状态,模型组相对于假手术组肺病理改变相对严重,肺泡代偿性扩张,支气管黏膜破坏,周围肺组织肺泡间隔增厚伴炎症细胞浸润,纤维组织增生,肺组织局部结构部分破坏,肺功能受到影响。吡非尼酮和血栓通注射液作用后可以显著改善模型组大鼠的肺纤维化严重程度,具体表现为减轻炎细胞浸润,减少肺间质增厚,减少肺泡壁增宽,降低纤维组织不同程度增生,降低组织病理评分。细胞外基质的表达:Western Blot的结果表明,造模7、14和28 d后,与假手术组相比,模型组大鼠的α-SMA、Vimentin和COL-I的表达增加,E-cad表达减少,吡非尼酮组和血栓通注射液组可以减少α-SMA、Vimentin和COL-I的表达,增加E-cad表达。胶原沉积:ELISA结果表明,造模7、14和28 d后,与假手术组比较,模型组大鼠肺组织中COL-I和FN水平显著升高。与模型组HIV phylogenetics比较,在7、14和28 d的结果中,吡非尼酮组和血栓通注射液高剂量组大鼠肺组织中的COL-I和FN水平显著降低,同时比较三个时间点,7 d的结果显著优于14 d和28 d的结果。免疫荧光的结果表明,造模7、14和28 d后,与假手术组相比,模型组大鼠的α-SMA和COL-I表达显著增加。吡非尼酮组和血栓通注射液组大鼠肺组织中α-SMA和COL-I表达显著减少。凝血因子:ELISA结果表明,造模7、14和28 d后,与假手术组比较,模型组大鼠肺组织中TAT,F1+2和SFMC水平显著升高。与模型组比较,在7、14和28 d的结果中,吡非尼酮组均没有显著性差异,7 d时血栓通注射剂高剂量组大鼠肺组织中SFMC含量的相对含量明显下降;14 d时血栓通注射剂低、中和高剂量组大鼠肺组织中SFMC含量的相对含量明显下降;28 d时各组无明显差异。7 d、14 d和28 d时各给药组大鼠肺组织中TAT,F1+2含量的相对含量无明显差异。2血栓通注射液有效成分三七总皂苷抗肺纤维化的机制研究PNS抑制THR诱导MRC-5细胞增殖:使用凝血酶刺激MRC-5细胞,选择安全浓度的三七总皂苷进行干预,凝血酶造模可显著诱导MRC-5细胞增殖。与凝血酶组比较,三七总皂苷可以抑制凝血酶引起的MRC-5细胞增殖。PNS对THR诱导的体外PF模型的影响:基于THR刺激成纤维细胞MRC-5细胞的体外肺纤维化模型:THR可以促进MRC-5细胞的异常增殖并使α-SMA和Vimentin水平增加,E-cad水平减少,PNS可以减少α-SMA和Vimentin相对表达水平,增加E-cad相对表达水平。PNS调控PAR-1发挥抗PF作用:实验结果显示,凝血酶刺激后PAR-1表达增加,而PNS可以使PAR-1表达减少。通过siRNA沉默技术,敲低了 PAR-1的表达,凝血酶刺激后,模型组α-SMA、Vimentin表达显著升高,E-cad表达显著减少,PNS对α-SMA、Vimentin和E-cad的改善作用并不明显,证明血栓通注射液是通过调节PAR-1这一靶点来调节相关蛋白的表达,从而改善肺纤维化。研究结论1血栓通注射液可以改善肺纤维化大鼠的整体生存状态,改善肺系数和肺功能,缓解炎细胞浸润和纤维组织增生,改善胶原沉积并抑制其上皮间质转化,具有抗肺纤维化的作用。2血栓通注射液发挥抗肺纤维化的作用与改善凝血系统异常有关。3血栓通注射液有效成分三七总皂苷可以调控凝血关键靶点PAR-1从而发挥抗肺纤维化作用。