莲为药食两用的重要经济作物,因其具有较高的营养、观赏及药用价值,已在亚洲有2000多年的应用历史。莲的多个组织部位,包括荷叶、莲房、莲子、莲子心、藕节等均被收载入《中国药典》,具有多种不同的功效。苄基异喹啉生物碱(benzylisoquinoline alkaloids,BIAs)是其中最重要的药效成分之一,具有降血脂、抗肥胖、抗癌、抗HIV、免疫调节等多种作用。目前莲中BIAs生物合成途径尚不清晰,解析BIAs生物合成途径有助于莲品质提升和创新药物开发。莲中BIAs结构的多样性是其功能多样性的化学基础,而甲基化修饰是其中BIAs结构多样化的关键。挖掘鉴定莲BIAs合成路径的甲基转移酶(MTs)将极大推进其生物合成途径的解析。本研究结合代谢组学、生物信息学和分子生物学技术对莲BIAs生物合成途径中甲基转移酶进行鉴定和功能分析,并对具有催化功能的MMirdametinib采购Ts进行分子改造,推进莲BIAs生物合成路径的解析,为莲的分子育种、品质提升奠定基础。同时,也促进莲中具有药用价值的BIAs的开发和利用,为进一步合理设计酶的改造提供科学依据。主要研究成果如下:1.前期课题组已完成莲荷叶、乳汁、莲子心、莲藕、花等不同组织的代谢组研究,本课题首先在课题组研究基础上,完善了莲代谢组学的研究。基于UPLC-PDA-ESI-Q-TOF-HRMSn对莲子进行了非靶向代谢组学研究。从5个动态发育时期莲种皮和子叶中共鉴定了 101个化合物,包括49个原花青素类、21个黄酮、22个生物碱和9个氨基酸类化合物,其中43个化合物为首次报道。研究发现莲种皮中含有大量的聚合原花青素类化合物,包括二聚体、三聚体和四聚体,从莲子叶中首次鉴定到三个生物碱糖苷类新化合物。同时,基于UPLC-Q-TOF-MS/MS建立了原花青素、黄酮和苄基异喹啉生物碱化合物的质谱解析策略,为课题后续的鉴定和分析工作奠定基础。通过对不同时期样本的91个化合物进行了相对定量,发现聚合原花青素和黄酮类化合物主要存在于种皮中,原花青素在成熟过程中出现从单体到聚合物的连续聚合过程;随着莲子的不断发育成熟,原花青素、类黄酮和氨基酸的总含量呈下降趋势。此外,苄基异喹啉生物碱(BIAs)作为莲中的主要生物活性成分,已在各个组织中深入研究,本研究对莲子中BIAs进行了相关性分析,并推导了可能的生物合成路径,发现苄基异喹啉生物碱合成路径中存在许多的甲基化过程。为此,对莲BIAs合成路径的甲基转移酶展开研究。2.本研究通过BLAST对莲基因组苄基异喹啉生物碱合成路径中甲基转移酶进行了挖掘,共筛选到11个O-甲基转移酶候选基因(NnOMTs)和1个N-甲基转移酶候选基因(NnNMT)。随后对NnOMTs和NnNMT进行了序列比对和系统发育分析。结果NnOMT6、NnOMT7、NnOMT10和NnOMT11与COMT距离较近,其中NnOMT6与来自块茎唐松草的几个OMTs聚在一簇,相似性高达80%,这些OMTs同时参与苯丙素类和BIAs化合物的合成;其余基因与BIAs合成路径中不同功能的OMTs分别聚成簇。所有莲候选NnMTs基因与报道的BIAs MTs氨基酸序列最高相似性均大于40%。根据课题组前期测定的转录组数据,分析了它们在不同花组织和叶组织中的表达量。已有报道叶中BIAs含量高于花组织,基于此积累模式,发现NnOMT6、NnOMT10、NnOMT11和NnNMT在叶组织中表达较高,具有催化活性的可能性更大。3.本研究利用原核表达系统对莲候选MTs进行了功能鉴定,发现三个甲基转移酶具有催化活性,其中两个为O-甲基转移酶(NnOMT6和Nn7OMT),一个为N-甲基转移酶(NnNMT),其余候选基因均无活性。研究发现,NnOMT6和Nn7OMT两个O-甲基转移酶具有底物混杂性和高度区域选择性。其中,NnOMT6 可以催化单苄基骨架(norcoclaurine、coclaurine、N-methylcoclaurine)的 C6 位和 C7 位、阿朴啡类骨架(asimilobine 和 N-methlyasimilobine)的 C6 位、原小檗碱类骨架(scoulerine)的C2位、苯丙酸类骨架的C3位(caffeic acid和chlorogenic acid)发生O-甲基化。Nn7OMT的作用位点主要在C7位,它可以催化双苄基异喹啉骨架(isoliensinine)的C7位、单苄基异喹啉骨架(norcoclaurine、coclaurine、N-methylcoclaurine)的Enasidenib纯度 C6 和 C7 位、阿朴啡骨架(lirinidine)的C7位和原小檗chronic virus infection碱骨架(scoulerine)的C9位发生甲基化,对isoliensinine的催化活性最强。具有创新性的是,Nn7OMT对isoliensinine的催化是一个新功能,也是目前发现的第一个催化双苄基异喹啉类骨架的O-甲基转移酶,它可能参与甲基莲心碱(neferine)的生物合成。NnNMT是一个高度特异的N-甲基转移酶,仅能催化N-去甲荷叶碱(N-nornuciferine)生成荷叶碱(nuciferine)。该酶也是一个新功能酶,是目前发现的第一个催化莲中阿朴啡类母核(苄基位无取代)的N-甲基转移酶,并且该酶具有底物专一性,对荷叶碱的生物合成具有重要意义。4.本研究为了探索NnOMT6、Nn7OMT和NnNMT三个基因在植物体内的功能,研究了它们在莲三个品种的幼叶、成熟叶、莲子心和花4个组织部位中表达量与BIAs代谢物积累量的关系。研究发现,NnOMT6在三个品种的成熟叶中表达量显著高于其他组织,但仅在花中与衡州乌药碱(coclaurine)的积累趋势相对一致,在不同品种叶和莲子心组织样本中与coclaurine的积累不完全一致,推测NnOMT6可能主要参与花中衡州乌药碱(coclaurine)的合成。Nn7OMT的表达量和双苄基异喹啉生物碱的积累模式一致,它们均具有高度的组织特异性,仅存在于莲子心中,Nn7OMT的表达量与甲基莲心碱(neferine)在三个品种的积累量相对一致,表明在植物体内Nn7OMT可能参与甲基莲心碱(neferine)的生物合成。NnNMT的表达量和阿朴啡类生物碱的积累量同样存在相同的组织特异性,NnNMT在莲子心中几乎没有表达,叶中表达量最高,分析发现NnNMT的表达量与荷叶碱(nuciferine)的积累量基本完全一致,表明NnNMT在植物体内参与荷叶碱的生物合成。5.本研究基于半理性设计对NnOMT6进行了工程改造研究,揭示了影响其活性的关键氨基酸残基。通过同源建模、分子对接和分子动力学模拟构建了NnOMT6-SAH与底物norcoclaurine结合的稳定构象,并通过MM-PBSA计算了复合物NnOMT6-SAH-norcoclaurine的结合自由能,找出对结合自由能贡献最大的几个关键氨基酸残基(N130、L135、H165、N176、N323、D316、L315、D269和E328)。针对这些残基构建了突变体并对进行酶活验证。发现D316A位点突变为丙氨酸后引起蛋白的完全失活,N130位点、L135位点、N176位点、D269A位点和E328位点的突变体均对BIA底物的催化活性显著降低,表明这些位点在蛋白活性维持中起重要作用。进一步讨论了它们在蛋白结构中扮演的角色,残基Asn130,Asp269和Glu328与底物norcoclaurine之间存在氢键相互作用,它们的突变可能降低蛋白质和底物之间的结合稳定性,导致活性降低。L135和D316位点位于底物norcoclaurine的附近,它们主要靠静电作用维持底物结合口袋的形状,发生突变后可能影响底物的位置,使底物不能处于合适的角度接受甲基,造成活性的降低。有创新性的发现是,本研究发现了一个对BIAs底物催化活性显著增强、底物范围更广的突变体(NnOMT6-N323A),可以作为生物催化剂用于相关化合物的生物合成。6.本研究基于半理性设计对Nn7OMT进行了工程改造。利用分子对接和分子动力学模拟对关键活性位点预测,并构建了 9个突变体(P308A,L154A,T307A,L140A,M158A,L109A,F144A,V306A,S191A)。经过酶活验证发现,所有突变体对异莲心碱的催化活性基本不变,但大多数的突变体对单苄基异喹啉类生物碱(去甲乌药碱、衡州乌药碱、N-甲基乌药碱)的活性显著降低,其中突变体M158A、V306A对这三个底物几乎无催化活性。Nn7OMT的分子改造虽未发现活性显著增强的突变体,但突变体M158A、V306A保持着对双苄基异喹啉生物碱的催化活性,但对单苄基类几乎无活性,增加了酶的专一性,这对未来利用Nn7OMT酶作为生物催化剂来说,解决了酶的底物混杂性引起的副产物较多的问题,以及降低了分离纯化工作的难度。7.本研究基于半理性设计对NnNMT进行了工程改造。找到了对NnNMT活性影响最大的几个关键残基F257、Y98、H208、F256、Y81、F329、G260、P76、H80。通过构建突变体验证发现,除F257外,其他残基突变为丙氨酸(Ala)后均对蛋白的活性造成很大影响,突变体F2561、Y98A、Y98G、Y98Q、Y81、H208A、G260A几乎失去活性,这些结果均表明这些残基在蛋白活性维持方面扮演重要角色。此外,本研究发现了一个活性增强的突变体F257A,通过对它的酶动力学参数测定证明突变体F257A提高了对N-Nornuciferine的催化效率。综上,本课题的研究发现将促进莲中苄基异喹啉生物碱(BIAs)合成路径的解析,同时也对莲BLAs的甲基化路径增加了新的认识,O-甲基化可以发生在双苄基异喹啉母核上,N-甲基化可以发生在阿朴啡类母核上。通过工程化改造为BIAs的合成提供了更有效、更特异的生物催化剂,促进具有药用价值的莲BIAs的开发与研究,同时也为进一步合理设计酶的改造提供科学依据。