一、研究背景淹溺是意外伤害导致死亡的第三位原因。在过去的十年中,淹溺导致了超过250万人死亡。不同国家和地区海水淹溺的比例存在差异,而且随着滨海旅游、海上作业等活动的增加,以及海洋国防事业的需求,海水淹溺人数可能会继续增加。肺脏是海水淹溺时容易受损的靶器官,1/3的非致命性淹溺患者会出现急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或者急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的诊断标准,这也被称为海水吸入诱导急性肺损伤(seawater aspiration induced acute lung injury,SW-ALI)。ALI/ARDS一种严重威胁生命的临床综合征,其特点是顽固性低氧性呼吸衰竭和胸部影像学上的双肺弥散性渗出。在ALI/ARDS进程中,肺泡上皮-血管内皮屏障功能的破坏,最终导致富含蛋白质的液体渗出到肺泡腔和肺泡间隙中。目前,尚无针对ALI/ARDS的有效药物治疗方案,主要采取机械通气、俯卧位、体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)、糖皮质激素等支持治疗。基于间充质干细胞的疗法是治疗ALI/ARDS有前景的疗法。临床前研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)可以有效减轻动物模型的肺损伤。但是,MSC的致瘤性、免疫原性、低移植率等问题限制了其应用。间充质干细胞来源的外泌体(MSC derived exosome,MSC-Exo)是由MSC分泌的一种细胞囊泡,继承了MSC的功能,而且具有更要的药代动力学。可能通过传递生物活性物质,发挥调节炎症信号通路、促进组织修复再生、抗微生物的作用。坏死性凋亡由刺激因素级联激活RIPK1、RIPK3、MLKL导致细胞出现受调控的死亡。坏死性凋亡诱发因素与凋亡类似,是细胞凋亡受阻时的备选死亡方式,形态学上与坏死表现相似,体现为细胞器肿胀、质膜破裂。越来越多的研究表明,坏死性凋亡在ALI/ARDS的进程中起着重要作用。而且最新的研究显示高渗应激、高血糖均可导致细胞出现坏死性凋亡。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)转录因子家族由五个亚型组成(NFAT1–NFAT5),调节T细胞的激活和分化,而且还调节细胞周期、死亡等的重要基因。通过生物信息学分析发现NFATc2为受体相互作用丝氨酸苏氨酸激酶1(receptor interacting serine threonine kinase 1,RIPK1)上游的转录因子,NFATc2可致使RIPK1的表达上调。由此我们推测,UMSC-Exo是否能通过影响NFATc2的表达从而减轻海水诱导的肺损伤呢?二、研究目的(一)优化海水诱导肺损伤的细胞模型条件,分离纯化脐带间充质干细胞来源的外泌体(UMSC derived exosome,UMSC-Exo),并在细胞模型中验证UMSCExo是否能减轻海水诱导肺损伤;(二)探讨UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤细胞模型可能的机制;(三)在体实验验证UMSC-Exo是否能减轻海水诱导小鼠肺损伤。三、研究方法(一)优化海水诱导肺损伤的细胞模型、鉴定所提取外泌体、研究UMSCExo对海水诱导肺损伤的作用首先通过CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂检测不同海水量和刺激时间对细胞活力的影响,确定海水诱导肺损伤细胞模型的构建条件。收集使用无外泌体血清培养的UMSC上清液,采用标准的差速离心法分离、纯化外泌体。采用Western Blot检测外泌体表达的标志蛋白、透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析外泌体粒径。使用含海水的培养基诱导后,更换新的正常培养基并加入UMSCExo,采用PKH-67染色检测UMSC-Exo能否被BEAS-2B细胞所摄取。通过CCK8检测细胞活力、JC-1试剂盒对线粒体膜电位染色、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞膜完整性、Annexin V试剂盒检测细胞死亡情况,研究UMSC-Exo对海水诱导细胞损伤的作用。(二)UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤细胞模型的机制研究首先,筛选海水诱导BEAS-2B细胞损伤中主要细胞死亡方式和关键调控基因。基于海水诱导肺损伤的细胞模型以及最佳治疗浓度UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤进行转录组测序。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)查找海水诱导后富集的细胞死亡方式而在UMSC-Exo治疗后受到抑制的细胞死亡方式为坏死性凋亡;通过WB检测海水诱导肺损伤中坏死性凋亡执行蛋白pMLKL、MLKL、p-RIPK3、RIPK1、RIPK3的及凋亡标志性蛋白Caspase-8的表达水平进一步验证。查找海水诱导后表达上调而UMSC-Exo治疗后表达下调的差异基因,通过生物信息学分析,发现可以靶向调控坏死性凋亡的转录因子,两者对比确定影响坏死性凋亡的关键基因NFATc2。通过WB和qPCR验证NFATc2在USMC-Exo减轻海水诱导BEAS-2B细胞损伤中的变化情况。通过荧光素酶试验的方法验证转录因子NFATc2对RIPK1的靶向调控作用。si-NFATc2转染BEAS-2B后,通过CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞及WB验证NFATc2在海水诱导坏死性凋亡中的作用。其次,筛选UMSC-Exo中能够靶向NFATc2的miRNA。从GEO数据库中查找脐带间充质干细胞外泌体的miRNA测序数据集,选取表达量排名前100的miRNA取交集;从数据库中(Target Scan、miRDB、miRWalk、mir DIP、miRTar Base)筛选能够调控NFATc2的miRNA,并与UMSC-Exo表达的miRNA进行比对,筛选出可以靶向调控NFATc2的候选miRNA,并与正常BEAS-2B细胞中候选miRNA表达量对比。设计构建候选miRNA的模拟物,通过WB和qPCR的方法验证可以靶向NFATc2的miRNA模拟物,进一步通过双荧光素酶的试验方法进行验证miRNA对NFATc2的靶向调控作用。使用CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞和WB验证目的miRNA模拟物在海水诱导细胞损伤中对NFATc2表达的影响及对坏死性凋亡的影响。(三)UMSC-Exo抑制坏死性凋亡减轻海水诱导小鼠急性肺损伤的验证研究采用经口气管插管缓慢注入海水的方法建立小鼠SW-ALI模型,治疗组注入海水6小时后给予USMC-Exo治疗。使用HE染色观察小鼠肺组织病理变化,通过量化肺组织损伤评分评估肺损伤的严重程度。通过腹主动脉采血进行血气分析评估气体交换障碍情况。通过小鼠肺组织称湿/干质量比评估肺水肿情况。使用胸部X线评估双肺渗出情况。检测肺泡灌洗液炎症因子评估炎症情况。对小鼠肺组织切片目的基因即坏死性凋亡相关进行免疫组织化学分析、免疫荧光染色。最后用Western Blot检测NFATc2和坏死性凋亡相关蛋白,验证在体实验结果是否同细胞实验结果一致。四、研究结果(一)制定海水诱导肺损伤细胞模型的条件、提取外泌体符合标准、UMSCExo减轻海水诱导细胞BEAS-2B损伤海水含量为20%的培养基刺激6h可以诱导BEAS-2B细胞活力下降达50%,并以此作为海水诱导肺损伤细胞模型的条件。Western Blot结果显示UMSC-Exo表达CD9、CD63、Alix,但不表达Calnexin。透射电镜下显示外泌体具有单层膜结构、一侧凹陷的半球形。粒径分析显示提取的UMSC-Exo直径集中在60-120nm之间。示踪实验表明UMSC-Exo能够被BEAS-2B细胞所摄取。相较于海水诱导组,加入UMSC-Exo治疗后细胞活力恢复,JC-1染色显示绿色荧光减弱、红色荧光增强,PI染色红色荧光减弱,死亡细胞数量减少。UMSC-Exo的治疗效果随着剂量的增加而增强,其最佳治疗浓度为50μg/ml。(二)UMSC-Exo来源的miR143-3p通过靶向调控NFATc2减轻海水诱导细胞坏死性凋亡实验一:NFATc2是调控海水诱导坏死性凋亡中的关键基因1、UMSC-Exo通过抑制坏死性凋亡减轻海水诱导的细胞损伤GSEA显示BEAS-2B受到海水刺激时出现的细胞死亡方式而在UMSC-Exo治疗后受到抑制的细胞死亡方式为坏死性凋亡显著(P<0.05)。WB结果显示,海水诱导后坏死性凋亡执行蛋白p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达增加,RIPK3表达有所降低,抑制坏死性凋亡的Caspase-8表达下降,MLKL表达变化不明显。而加入UMSC-Exo后p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达下降,RIPK3表达增加,Caspase-8表达增加,MLKL表达变化不明显。2、转录组测序筛选海水诱导BEAS-2B细胞损伤中的差异表达基因海水诱导后表达上调,在UMSC-Exo治疗后表达下调的基因有26个,其中包括4个转录因子:NFATc2、LTF、MAFF、NR4A3。热图显示差异显著性排名前50基因中所含的转录因子:NFATc2、LTF、MAFF。火山图中差异显著性最大的基因为:NFATc2。3、生信分析可能靶向坏死性凋亡的转录因子及验证PROMO数据库找RIPK1的预测转录因子,与转录测序筛选的有差异的四个转录因子进行对比,预测转录因子NFATc2可能是调控坏死性凋亡的关键基因。JASPAR网站中查找NFATc2能够在RIPK1启动子的结合位点序列并设计结合位点突变序列。荧光素酶实验结果显示,NFATc2质粒能够与野生型RIPK1启动子序列结合、荧光增强。4、NFATc2在UMSC-Exo治疗海水诱导肺损伤细胞模型中的表达验证WB和qPCR检测发现海水诱导后NFATc2的m RNA和蛋白表达水平均增加,UMSC-Exo治疗后NFATc2的m RNA和蛋白表达水平均将低。5、NFATc2在si RNA转染的BEAS-2B细胞中与坏死性凋亡关系通过CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞及WB验证NFATc2在海水诱导坏死性凋亡中的作用。(1)si-NFATc2转染的细胞NFATc2的m RNA和蛋白表达水平下降;(2)si-NFselleck BlebbistatinATc2转染后的细胞减少海水诱导的细胞活力下降;(3)si-NFATc2转染后的细胞降低海水诱导的线粒体膜电位下降;(4)si-NFAmedical competenciesTc2转染后的细胞降低海水诱导的细胞膜破坏;(5)si-NFATc2转染后的细胞减少海水诱导的细胞死亡;(6)si-NFATc2转染后的细胞海水诱导后p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达下降,RIPK3表达增加,Caspase-8表达增加。上述结果提示si-NFATc2转染细胞后NFATc2表达下调,坏死性凋亡相关蛋白的表达受到负性调节,抑制了坏死性凋亡的发生。实验二:UMSC-Exo通过miR143-3p靶向调控NFATc21、UMSC-Exo中靶向调控NFATc2的miRNA筛选结果GSE159814和GSE69909数据集中表达量排前100的miRNA共有51个;Target Scan、miRDB、miRWalk、mir DIP、miRTar Base数据库预测可能结合到NFATc2基因3’UTR的miRNA共6个,两者再次取交集获得候选miRNA共4个:miR-7-5p、miR-143-3p、miR-221-3p、miR-222-3p。4个候选miRNA在正常BEAS-2B中的表达量均在较低水平。2、UMSC-Exo中靶向调控NFATc2的候选miRNA的验证4个候选miRNA模拟物转染细胞后,miR-143-3p的模拟物使NFATc2的m RNA和蛋白水平表达下降。查找miR-143-3p在NFATc2基因m RNA上3’UTR的结合位点序列,设计构建野生型、突变型结合位点载体,荧光素酶实验表明,miR-143-3p模拟物使野生型3’UTR荧光强度明显减弱,说明miR-143-3p能够与NFATc2的3’UTR靶向结合。3、miR-143-3p对海水诱导BEAS-2B细胞坏死性凋亡的影响(1)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转然后可以减轻海水诱导的细胞活力下降;(2)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以使海水诱导的细胞线粒体膜电位增加;(3)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以减少海水诱导细胞膜质膜破坏;(4)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以减少海水诱导细胞死亡;(5)与UMSC-Exo效果相似,海水诱导细胞坏死性凋亡增加,miR-143-3p模拟物转染后可以抑制海水诱导细胞死亡。(三)UMSC-Exo抑制坏死性凋亡减轻海水诱导小鼠急性肺损伤中的在体验证研究1、小鼠动脉血气的变化海水诱导小鼠肺损伤可导致pH、pO2、SaO2出现明显的下降,pCO2、乳酸HCO3-升高。UMSC-Exo治疗后,pH、pO2、SaO2有所上升,pCO2、乳酸HCO3-下降。2、小鼠胸部X线改变海水诱导后小鼠胸部X线出现双肺弥漫性渗出,经UMSC-Exo治疗后小鼠双肺渗出有所减少。3、小鼠肺脏病理改变及肺组织损伤评分海水诱导后小鼠肺组织出现明显的中性粒细胞浸润、肺泡间隔增厚、肺泡塌陷、肺泡腔和间质出血增加;UMSC-Exo治疗后,中性粒细胞浸润减少、肺泡间隔厚度减少,肺泡腔和间质出血。海水诱导后小鼠肺组织的肺损伤评分增加,UMSC-Exo治疗后肺损伤评分降低。4、小鼠肺组织湿/干质量比海水诱导后小鼠肺组织湿/干质量比增加,UMSC-Exo治疗后,湿/干质量比降低。5、小鼠肺泡灌洗液炎症因子检测海水诱导后小鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α明显增高,给予UMSC-Exo治疗后可明显下降。6、肺组织NFATc2、p-MLKL、RIPK1免疫组织化学海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、RIPK1的表达增加。UMSC-Exo治疗后NFATc2、p-MLKL、RIPK1的表达下降。7、肺组织NFATc2、pwww.selleck.cn/products/MK-1775-MLKL、RIPK1免疫荧光海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、RIPK1的荧光增强、表达增多。UMSC-Exo治疗后NFATc2、p-MLKL、RIPK1的荧光减弱、表达减少。8、肺组织NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、MLKL、RIPK3、RIPK1、Caspase-8的蛋白印迹检测海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达增加,RIPK3、Caspase-8是下降的。外泌体治疗后NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1表达有所降低,RIPK3、Caspase-8有所升高。五、研究结论(一)UMSC-Exo可以减轻海水诱导BEAS-2B细胞损伤;(二)UMSC-Exo通过miR-143-3p靶向调控NFATc2抑制坏死性凋亡减轻海水BEAS-2B细胞损伤;(三)在体实验中UMSC-Exo减轻海水诱导小鼠急性肺损伤,NFATc2及坏死性凋亡相关蛋白表达与离体细胞实验结果一致。