顺9反11-共轭亚油酸(Cis9,trans11-conjugated linoleic acid,c9,t11-CLA)是牛奶的一种重要营养成分。在奶牛乳腺,硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-co A desaturase1,SCD1)催化反式11十八碳烯酸(Trans11 vaccenic acid,TVA)合成c9,t11-CLA。团队前期研究证明SCD1基因被抑制后,奶牛乳腺上皮细胞(Mammary a寻找更多lveolar cells-large Tantigen,MAC-T cells)中c9,t11-CLA的合成量降低,且PGLS,PFKL,ALDOA,TPI1,GAPDH,PGK1,PGAM1,ENO1,PKM,LDHA和LDHB等能量代谢相关基因呈上调趋势。因此本试验以SCD1为切入点,通过细胞试验和动物验证试验,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)、实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)、平Belumosudil化学结构行反应监测(Parallel reaction monitoring,PRM)等技术研究了上述11个能量代谢相关基因与奶牛乳腺合成c9,t11-CLA的关系。试验结果如下:试验一:根据11个候选基因(PGLS,PFKL,ALDOA,TPI1,GAPDH,PGK1,PGAM1,ENO1,PKM,LDHA和LDHB)mRNA序列设计特异性小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA:siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),当MAC-T cells覆盖率达到80%时,利用Lipofectamine(?)RNAi MAX转染试剂将siRNA或scramble输送到细胞内,分别建立了11个候选基因被沉默的MAC-T cells模型。结果显示本研究设计的特异性siRNA均可以显著降低对应基因的mRNA相对表达量(P<0.01),当PGLS(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),PFKL(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),ALDOA(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),TPI1(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),GAPDH(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),PGK1(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),PGAM1(siRNmitochondria biogenesisA-1),ENO1(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),PKM(siRNA-2,siRNA-3),LDHA(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),LDHB(siRNA-3)被沉默后,SCD1的mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01),当LDHB(siRNA-2)被沉默后,SCD1的mRNA相对表达量显著增加(P<0.05)。试验二:从牛奶中分离乳源奶牛乳腺上皮细胞(Milk epithelial cells,MECs),首先利用Real-time PCR技术测定了LSP1,HBA,HBB基因在MAC-T cells,MECs和乳体细胞(Milk somatic cells,MSCs)中的mRNA相对表达量,结果显示MECs与MAC-T cells中的LSP1,HBA,HBB基因mRNA相对表达量差异不显著,表明分离的MECs具有较高的纯度,可用于后续Real-time PCR和PRM试验。然后根据牛奶中c9,t11-CLA的含量,将MECs分为c9,t11-CLA高产奶牛组(HIGH组)和c9,t11-CLA低产奶牛组(LOW组),利用Real-time PCR对比分析了11个候选基因在两组MECs间的表达差异。结果显示PFKL和PGAM1的mRNA相对表达量在c9,t11-CLA高产奶牛组(HIGH组)极显著低于c9,t11-CLA低产奶牛组(LOW组)(P<0.01);ALDOA,GAPDH和PGK1的mRNA相对表达量在HIGH组显著低于LOW组(P<0.05);PGLS,TPI1,ENO1,PKM,LDHA和LDHB的mRNA相对表达量在HIGH组与LOW组无显著差异(P>0.05)。PRM结果显示ALDOA,GADPH,PGAM1和PKM与SCD1负相关。本试验通过细胞试验验证了11个能量代谢相关基因与SCD1的关系,利用动物验证试验确定了ALDOA,GADPH,PGAM1与SCD1负相关,进而参与奶牛乳腺中的c9,t11-CLA合成。