研究背景与目的:特发性肺纤维化是一种病因未明的慢性纤维化性间质性肺炎,主要特征为肺内弥漫性胶原沉积、肺泡组织结构破坏以及纤维瘢痕和蜂窝囊形成,临床表现为不可逆的肺通气、换气功能减退,生存质量严重降低,现阶段特发性肺纤维化的治疗手段极为有限,患者预后极差。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有独特的诱导增殖分化潜能,应用其修复各器官及组织损伤成为一种新型生物疗法。近年来,应用人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)治疗多种肺部疾病的基础研究逐渐增多,疗效得到初步证实。然而,直接将hUC-MSCs应用于临床存在许多不容忽视的问题,如细胞来源匮乏、传代后增殖分化潜能下降、归巢能力不足、于损伤处停留时间有限并具有成瘤风险,严重阻碍了其从实验室向临床转化。外泌体(exosomes,exos)是一种由细胞分泌的、大小介于50～150nm的微小囊泡,其内含有脂质、核酸、蛋白质等成分,可被受体细胞接收从而参与细胞间通讯。既往研究发现,MSC主要通过旁分泌方式发挥生物作用,外泌体作为其中的主要介质具有巨大的治疗潜能。应用MSC-exos不仅避免了直接移植MSC的诸多风险,而且便于存储、运输。在外泌体内包裹的生物活性物质中,微小RNA(microRNA,miRNA)因其具备靶向调控基因的能力备受关注。有研究证实,供体细胞的miRNA可以通过外泌体转运至受体细胞,并对受体细胞的基因进行“重编程”。同时,外泌体还能够保护其内的miRNA在高温、酸碱、反复冻融等环境下仍然稳定。本课题组前期实验发现缺氧预处理可以抑制hUC-MSCs线粒体凋亡通路的激活从而增强其抗凋亡能力,并显著强化hUC-MSCs旁分泌功能。有研究发现缺氧预处理可显著提升MSCs及其外泌体中miRNA的表达量,并加强其对损伤组织的修复能力。因此,深入研究缺氧预处理的hUC-MSCsselleck HPLC-exos对肺纤维化的影响并探求其内miRNA的调控机制,将为其应用于临床提供更多依据。研究内容:第一部分缺氧预处理的hUC-MSCs来源外泌体的提取与鉴定实验方法:1、培养hUC-MSCs并进行缺氧预处理,使用超速离心技术提取其外泌体,通过透射电镜观察、粒径分析和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测外泌体表面标志性蛋白CD9、CD63和TSG101的水平,对所提外泌体进行鉴定。2、Western blot检测缺氧预处理的hUC-MSCs中HIF-1α和Rab27a的水平,明确缺氧预处理对hUC-MSCs外泌体分泌的影响。实验结果:1、超速离心技术能够成功提取hUC-MSCs的外泌体,缺氧预处理可诱导hUC-MSCs外泌体分泌增多。2、缺氧预处理使hUC-MSCs中HIF-1α、Rab27a的水平升高。第二部分缺氧预处理的hUC-MSCs-exos对肺纤维化的干预作用实验方法:1、通过腹腔注射博来霉素构建肺纤维化小鼠模型,造模结束后给予尾静脉注射hUC-MSCs-exos或缺氧预处理的hUC-MSCs-exos进行干预,记录小鼠生存状态及体重变化,留取肺组织行病理HE、Masson、免疫组化染色,检测羟脯氨酸含量并通过Western blot检测Collagen-Ⅰ、PAI-1和αSMA的水平,判断干预效果。2、通过TGF-β1诱导人肺泡上皮细胞A549细胞构建上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)模型,与 hUC-MSCs-exos 或缺氧预处理的 hUC-MSCs-exos共培养并使用共聚焦荧光显微镜观察外泌体进入A549细胞的情况,通过 Elisa、Western blot 检测 Collagen-Ⅰ、Fibronectin、αSMA、Vimentin和SMAD4的水平,评估外泌体对EMT的影响。实验结果:1、在动物实验中,给予博来霉素诱导后小鼠出现毛发干枯、活动减少、呼吸急促以及体重减轻等现象,结合肺组织病理学表现可判断肺纤维化小鼠模型构建成功;给予hUC-MSCs-exos或缺氧预处理的hUC-MSCs-exos干预后小鼠症状减轻,体重有所恢复,肺组织病理学表现提示肺泡炎及肺纤维化程度减轻,羟脯氨酸检测结果提示胶原沉积减少,免疫组化染色和Western blot检测结果提示Collagen-Ⅰ、PAI-1和αSMA的水平降低;其中,缺氧预处理的hUC-MSCs-exos在减轻小鼠肺间质Collagen-Ⅰ沉积上效果更为明显。2、在细胞实验中,共聚焦荧光显微镜下可见hUC-MSCs-exos和缺氧预处理的hUC-MSCs-exos进入到A549细胞内,抑制TGF-β1诱导的A549细胞分泌Collagen-Ⅰ和 Fibronectin,降低 A549 细胞内 αSMA、Vimentin 和 SMAD4 的水平,有效减轻其EMT程度;值得注意的是,缺氧预处理的hUC-MSCs-exos可明显抑制A549细胞分泌Collagen-Ⅰ。第三部分缺氧预处理的hUC-MSCs-exos减轻肺纤维化的机制研究实验方法:1、在 GEO 数据库中以“umbilical”、“mesenchymal stem cell”和“exosome”为检索词进行全面检索,筛选出合适数据并进行整合分析,按照含量排序找出排名前五的miRNA;RT-qPCR检测TGF-β1诱导的A549细胞与缺氧预处理的hUC-MSCs-exos共培养后这五个miRNA的表达水平变化情况,最终筛选出缺氧预处理的 hUC-MSCs-exos 中的关键 miRNA:miRNA-146a-5p(miR-146a-5p);通过生物信息学预测miR-146a-5p与SMAD4的结合位点,利用双荧光素酶报告基因检测验证两者的靶向性关系。2、使用 miR-146a-5p mimics、miR-146a-5p inhibitor 构建高、低表达 miR-146a-5p的A549细胞模型并诱导其发生EMT,通过Elisa、Western blot检测Collagen-Ⅰ、Fibronectin、αSMA、Vimentin、PAI-1 的水平以判断 miR-146a-5p 对 A549细胞EMT的影响;Western blot检测 SMAD4水平以判断miR-146a-5p对A549细胞SMAD4表达的影响;构建低表达SMAD4的A549细胞模型并共转染miR-146a-5p inhibitor,检测上述肺纤维化相关蛋白水平以判断miR-146a-5p/SMAD4对A549细胞EMT的影响。3、RT-qPCR检测缺氧预处理对hUC-MSCs及其外泌体中miR-146a-5p表达的影响;RT-qPCR检测A549细胞与缺氧预处理的hUC-MSCs-exos共培养后其内miR-146a-5p的表达水平;抑制缺氧预处理的hUC-MSCs-exos的miR-146a-5p表达并通过Elisa、Western blot检测判断其对A549细胞SMAD4和EMT的影响。实验结果:1、双荧光素酶报告基因检测证实SMAD4受miR-146a-5p的靶向调控,是miR-146a-5p靶基因。2、随着TGF-β1刺激时间延长,A549细胞内miR-146a-5p的表达逐渐降低;过表达miR-146a-5p能够减轻TGF-β1诱导的A549细胞EMT并抑制SMAD4的表达;敲低miR-146a-5p表达能够促进EMT并上调SMAD4的表达,沉默SMAFGFR抑制剂D4可以拮抗敲低miR-146a-5p表达所致的促进EMT的作用。3、缺氧预处理后,hUC-MSCs及其外泌体的miR-146a-5p表达水平呈时间依赖性增加;缺氧预处理的hUC-MSCs-exos的miR-146a-5p可转移至A549细胞内并发挥减轻EMT和抑制SMAD4表达的作用,抑制外泌体内miR-146a-5p表达后,这一作用明显减弱。研究结论:1、超速离心技术可以成功分离提取hUC-MSCs的外泌体,缺氧预处理对hUC-MSCs外泌体的分泌有促进作用。2、hUC-MSCs-exos和缺氧预处理的hUC-MSCs-exos能够减少肺纤维化小鼠肺组织内肌成纤维细胞数量并抑制胶原蛋白等细胞外基质沉积,改善肺纤维化。3、hUC-MSCs-exos和缺氧预处理的hUC-MSCs-expost-challenge immune responsesos能够进入肺泡上皮细胞内发挥减轻EMT的作用。4、缺氧预处理能够上调hUC-MSCs-exos中miR-146a-5p的表达,miR-146a-5p靶向抑制SMAD4进而减轻肺泡上皮细胞EMT,发挥抗纤维化作用。