禽呼肠孤病毒(Avianreovirus,ARV)属正呼肠孤病毒科,正呼肠孤病毒属成员。禽类感染ARV可发生病毒性关节炎、矮小综合征、免疫抑制等临床疾病以及炎性细胞浸润等病理变化。p17蛋白是ARV S1基因编码的非结构蛋白之一,可以激活p53/PTEN/MTORC1、AMPK、PKR/eIF2α等信号通路,通过改变p17 NLS核定位信号促进细胞自噬和生长迟缓,为病毒的复制创造有利条件。ARV与宿主之间的相互作用是完成其致病和复制的重要环节。因此,筛选非结构蛋白p17相互作用的宿主蛋白,可为后续阐明p17蛋白的功能和探究ARV的致病机制奠定基础。本文主要研究内容如下:1.细胞PQBP1通过其WWD结构域与ARV p17相互作用通过酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-p17转化酵母感受态www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate细胞YH2-Gold 与鸡肝 cDNA 文库 Y187 菌杂交,分别经 SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-TrOncology nursep缺陷培养基三次筛选后得到阳性菌落。提取质粒测序后,经BLAST 比对得到12个可与p17互作的潜在的宿主蛋白,这12个宿主蛋白分别为:RPL5(核糖体蛋白L5)、RPL7(核糖体蛋白L7)、DLG1(巨盘状蛋白1)、DHRS3(还原酶)、NEDD4L(神经前体细胞表达发育下调样基因4)、FERM domain-containingprotein 8(FRMD8)、ZNF598(锌指蛋白 598)、PQBP1(聚谷氨酰胺结合蛋白1)、蜡样芽胞杆菌16srRNA(B37株)、假设蛋白以及两个预测蛋白。这些宿主蛋白大部分与癌症相关,具有抑制肿瘤因子增殖、调节细胞分化迁移、调节免疫反应与促进基因表达的功能。其中,多聚谷氨酰胺结合蛋白1(PQBP1)因其具有调节宿主先天免疫功能,我们对其进行深入研究。通过PCR方法从鸡肝组织中扩增得到PQBP1基因,构建PQBP1-pDsRedN1-Red(以下简称 PQBP1-Red)与 pcDNA(3.1+)-Flag-PQBP1(以下简称 Flag-PQBP1)真核质粒。与实验室保存的pEGFP-C1-p17(以Nirmatrelvir半抑制浓度下简称p17-GFP)、pcDNA(3.1+)-Myc-p17(以下简称Myc-p17)、GST-p17通过激光共聚焦、免疫共沉淀和GST pull down等实验进一步验证二者的相互作用关系。结果显示,PQBP1与p17蛋白无论在细胞内或细胞外均存在相互作用,且在细胞中具有共定位现象。然后通过生物学软件对PQBP1的结构域进行分析,发现其蛋白可分为3个结构域。据此,分别构建带Flag标签的pcDNA(3.1+)-Flag-WWD(以下简称Flag-WWD)、pcDNA(3.1+)-Flag-PRD(以下简称Flag-PRD)、pcDNA(3.1+)-Flag-CTD(以下简称Flag-CTD)真核表达质粒,并进一步通过免疫共沉淀和激光共聚焦探究PQBP1与p17的互作结构域。结果表明,在PQBP1的三个结构域中仅有Flag-WWD能p17相互作用,且在激光共聚焦中可观察到其与Myc-p17的共定位现象。因此得出PQBP1蛋白是通过其WWD结构域实现与ARV p17蛋白的相互作用。2.PQBP1上调炎性因子表达并抑制ARV复制为了探究宿主蛋白PQBP1能否对ARV复制产生影响。在HD11细胞上接种1个MOI ARV,于不同时间点收取细胞RNA及蛋白样品。在明确ARV随着感染时间延长,其增殖量显著增加的基础上,通过检测发现,PQBP1蛋白的表达量逐渐降低。进而,分别通过转染Flag-PQBP1质粒与靶向PQBP1基因的siRNA,实现在HD11细胞中对PQBP1蛋白的过表达与敲低表达。在此基础上,感染ARV,并检测病毒增殖水平。结果显示,过表达PQBP1后,ARV的增殖量明显下降;而敲低PQBP1蛋白表达,ARV增殖显著提高。因此,得出宿主蛋白PQBP1可作为ARV在细胞上的负调控因子,抑制病毒的增殖。为了探究宿主蛋白PQBP1抑制ARV的复制机制。在HD11细胞中外源表达p 17蛋白或感染ARV,通过RT-qPCR检测下游炎性因子IL-18、IFN-β、Caspase-1的表达量变化。结果显示,表达p17蛋白或ARV感染均引起的炎性因子显著上调表达,且其变化趋势相似,说明p17蛋白参与ARV引起的炎症反应。以此为基础,我们进一步研究PQBP1蛋白在这一过程中是否发挥作用。首先,在HD11细胞中实现对PQBP1蛋白的过表达与敲低后,分别表达p17蛋白和感染ARV病毒,通过 RT-qPCR、Western blot 和 ELISA 方法检测细胞中 IL-18、IFN-β、Caspase-1炎性因子表达水平。结果显示,相对于正常细胞感染ARV组,当细胞中过表达PQBP1时,ARV引起的IL-18、IFN-β、Caspase-1基因及蛋白水平表达均显著升高;与此相反,当沉默PQBP1后,ARV感染后IL-18、IFN-β、Caspase-1表达量均有降低。在此基础上,通过Western blot检测过表达与敲低PQBP1后pp65的翻译水平,研究PQBP1对NF-κB信号通路激活的影响。当HD11细胞中过表达PQBP1,Western blot检测磷酸化p65的含量同样升高,表明PQBP1能够促进p65蛋白入核。当调低PQBP1的表达时,磷酸化p65的含量显著降低,抑制入核。因此,得出宿主蛋白PQBP1可激活NF-κB通路,上调炎性因子的产生,促进抗病毒感染的炎症反应。本研究通过酵母双杂交技术筛选得到能与p17相互作用的宿主蛋白PQBP1,并通过co-IP、GST-Pulldown及激光共聚焦进一步证实两者存在相互作用。在此基础上,进一步研究发现PQBP1蛋白可以抑制ARV的增殖并促进炎症因子的分泌上调,其机制为ARV通过p17与PQBP1互作,达到激活NF-κB信号通路,促进p65入核,抑制病毒复制。