红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是中国重要的经济鱼种,有巨大的市场潜力。近年来,随着市场需求增加,人工集约化养殖红鳍东方鲀的产业得到了快速的发展,这对推动中国渔业经济具有重要的作用。人工集约化养殖红鳍东方鲀产业的快速发展,使得这种高密度养殖模式易发鱼类疾病,其中刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)病给红鳍东方鲀养殖业造成了巨大的经济损失,严重的制约了海水鱼养殖业的良性发展,是养殖企业急需解决的疾病之一。本研究从鱼体免疫着手,深入研究红鳍东方鲀免疫防御机制,探讨红鳍东方鲀抗刺激隐核虫病的有效途径。我们采用转录组学分析红鳍东方鲀的鳃组织,蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析红鳍东方鲀的脾脏组织,整合组学数据结果后,我们筛选出关键的免疫细胞因子白介素-1β(interleukin-1beta,IL-1β),并结合分子生物学和细胞生物学的方法分析验证IL-1β通过MAPK和NF-κB信号通路行使抗刺激隐核虫的功能。首先我们采用转录组学测序分析健康红鳍东方鲀和感染刺激隐核虫的红鳍东方鲀的鳃组织,筛选免疫相关的差异表达基因和免疫信号通路。通过主成分分析(PCA)、GO注释分析和KEGG注释分析,我们筛选出免疫信号通路类别中Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NOD样受体信号通路和C型凝集素受体信号通路显著富集。在免疫相关的信号通路中,我们发现在红鳍东方鲀中白介素-1β(IL-1β)、转录激活因子(AP-1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)和核因子κB(NF-κB)基因表达显著上调。数据结果表明这些免疫信号通路和显著表达上调基因在红鳍东方鲀抗刺激隐核虫过程中有重要免疫调控作用。为了更深入的了解红鳍东方鲀抗刺激隐核虫感染的防御机制,我们利用蛋白质组学和磷酸化肽富集技术对红鳍东方鲀的脾脏组织进行分析。通过蛋白质组学的分析,我们得到83个显著差异蛋白,在2,815个磷酸化蛋白。将差异蛋白和差异磷酸化蛋白进行GO注释分析、KEGG注释分析、COG注释分析和蛋白质互作分析,发现白介素-1β(IL-1β)、抗菌肽(hepcidin)、G蛋白信号调节因子(G-protein-signaling modulator)、醌氧化还原酶PIG3(quinone oxidoreductase PIG3)、丝裂原活化蛋白激酶5-like(MAPK 5-like)、蛋白激酶C型(PKCθtype)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/thimmediate postoperativereonine-protein kinase)、锌指蛋白850(ZFP 850)参与了宿主的免疫应答,这些蛋白参与MAPK信号通路、坏死性凋亡、TGF信号通路和p53等信号通路。通过转录组学和蛋白质组学联合分析筛选的免疫基因更能体现该基因在红鳍东方鲀个体水平上抗刺激隐核虫感染过程中的重要性和准确性。结合转录组学和蛋白质组学的数据结果,我们综合分析筛选出白细胞介素-1β可能在抗刺激隐核虫过程中有重要免疫调控作用。在我们的组学研究结果中,IL-1β在鳃组织和脾脏组织显著上调表达,通过GO注释分析和KEGG注释分析发现IL-1β参与了参与MAPK信号通路、Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路等信号通路,蛋白互作分析IL-1β与多个蛋白相互作用,位于关键位置。作为重要的免疫调节因子IL-1β备受研究者们的关注,在前期的报道中,IL-1β在鱼类细菌病和病毒病中有重要的免疫调节作用,我们推测IL-1β可能在抗寄生虫的免疫反应过程中发挥重要调控作用,其具有重要的研究价值,所以我们选择IL-1β进一步功能验证研究。在本更多研究中对TrIL-1β(Takifugu rubripes interleukin-1beta)采用细胞生物学方法和分子生物学方法验证其蛋白功能。首先进行了氨基酸序列特征分析,通过多序列比对分析、保守结构域的基序分析、系统发育分析和蛋白质结构预测分析,结果表明尽管鱼类IL-1β的序列存在差异,但TrIL-1β保守结构域、基序的组成和位置仍然GSK2118436高度保守,TrIL-1β具有典型的IL-1家族序列特征。系统进化分析显示,与大西洋鲑IL-1β亲缘关系最近(67.2%),其次为斑马鱼IL-1β(31.7%)。IL-1β基因在健康红鳍东方鲀的(鳃、脾脏、头肾、肝、肠、皮肤)组织中广泛表达。RT-q PCR结果显示脾脏组织IL-1β基因相对表达量最高,其次是鳃组织和头肾组织,在皮肤、肠道、肝脏组织中检测到IL-1β相对较低水平的基因表达量。体外重组TrIL-1β蛋白与滋养体共孵育实验检测其生物活性,按照100 ng/m L TrIL-1β浓度与滋养体共孵育1h后,发现滋养体膜逐渐破裂内容物流出,滋养体呈现不规则的形态,表明TrIL-1β具有破坏滋养体膜的潜在杀伤活性。接下来对鳃组织和脾脏组织进行了免疫荧光实验,显示IL-1β组的红色荧光强度显著高于PBS组、BSA组、INF组,结果表明重组TrIL-1β可诱导内源性IL-1β表达增加,同时,在鳃组织免疫荧光图片中发现第3天时IL-1β红色荧光主要集中在滋养体膜上到第6天IL-1β红色荧光充满滋养体,这个结果再次验证了IL-1β可以逐渐穿透破坏滋养体膜并杀伤滋养体,阻断刺激隐核虫的繁殖周期。透射电镜观察鳃组织和脾脏组织,结果显示IL-1β组的鳃组织和脾脏组织的炎症程度轻于BSA组和INF组,这表明TrIL-1β蛋白对组织的炎症有一定的抑制。在头肾原代细胞(HKPCs)中进行了IL-1β-si RNA和IL-1β过表达实验,实验结果表明IL-1β对My D88、NF-κB、MAPK和p38基因具有调控作用。我们进一步在鱼体上进行攻毒实验,RT-q PCR结果表明重组TrIL-1β可以调节My D88、NF-κB、MAPK、p38和Ig M基因的表达,IL-1β通过参与调节My D88\NF-κB和My D88\MAPK\p38信号通路来行使抗刺激隐核感染的功能。此外,TrIL-1β可以促进Ig M基因的差异表达,表明TrIL-1β参与调节鱼类的体液免疫。死亡率累计实验表明,重组TrIL-1β组与BSA组和INF组相比,可以显著提高鱼体的成活率,推迟鱼体的死亡时间。基于这些数据,我们推测TrIL-1β在感染早期诱导内源性IL-1β的高表达,调节My D88\NF-κB和My D88\MAPK\p38通路,并分泌IL-1β、IL-27、AP-1等细胞因子,增强鱼类的免疫,参与抵抗刺激隐核虫的感染,并且IL-1β可以直接阻断刺激隐核虫的生活史,延缓红鳍东方鲀的死亡时间,提高鱼的存活率。通过本研究发现IL-1β具有抗刺激隐核虫感染的潜在的生物学功能,参与鱼体免疫调节,促进相关免疫基因的表达,对鱼体具有免疫防护功能,提示TrIL-1β可作为潜在的细胞因子佐剂用于亚单位疫苗,可应用于疫苗研发的潜在蛋白质,对防控刺激隐核虫病具有深远的意义。