红三叶(Trifolium pratense L.)为豆科三叶草属植物中最重要的牧草之一,是推进国家奶业振兴计划的战略物资和草牧业发展的基础原料。培育高产优质红三叶品种,已成为推动草牧业高质量发展的主要途径之一。分枝性能是红三叶重要农艺性状,决定草产量和株型,而植物激素对调控植物分枝性能具有关键作用。因此对调控红三叶分枝性能的植物激素和分枝基因进行研究,筛选和鉴定关键分枝候选基因,并借用分子手段将其应用到红三叶育种,对拓宽红三叶育种资源,改良红三叶株型和产量,培育高产稳产红三叶新品种具有极其重要的意义。鉴于此,本研究以红三叶分枝数较多单株(MB)和分枝数较少单株(FB)的扦插苗为试验材料,通过测定2个群体表型BMS-907351核磁及内源激素含量,分析外源激素调控下分枝相关基因表达模式和分枝表型结果,筛选克隆得到编码细胞色素P450单加氧酶的MAX1基因(TpMAX1),并遗传转化至拟南芥进行功能验证。此外,比较了不同红三叶材料的再生能力,得出红三叶转基因最佳转化受体材料,对其进行农杆菌介导的遗传转化影响因素研究,为红三叶TpMAX1基因功能解析及红三叶转基因育种奠定基础。主要结果如下:1.与FB植株相比,MB植株分枝数和干草产量显著增加,株高显著降低;初花期MB植株平均脱落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素(gibberellin,GA)、5-脱氧独角金醇(5-DS)和GA_3/ZT均显著高于FB。不同组织部位中,腋芽中平均玉米素(zeatin,ZT)含量最高,茎秆中平均生长素(auxin,IAA)含量最高,叶片中平均ABA、5-DS、IAA/ZT和ABA/ZT最高,根系中平均GA_3和GA_3/ZT最高。相关性分析结果表明:分枝数与ABA、GA_3、ABA/ZT和GA_3/ZT极Nirogacestat溶解度显著正相关,与IAA、5-DS和IAA/ZT显著正相关。2.外源IAA对MB分枝数有显著促进作用,对株高则有明显抑制作用;人工合成的SL类似物GR24(rac-GR24)和ABA对MB分枝数和株高均有明显抑制作用;GA_3对MB分枝数有明显抑制作用,对株高则有明显促进作用。采用荧光定量PCR分析红三叶分枝相关基因在不同外源激素处理下转录水平差异表明:外源IAA、rac-GR24、ABA和GA_3均可诱导红三叶TpMAX1、TpD27、TpCCD8、TpD14、TpDELLA、TpSPS和TpRAX3基因表达;4种外源激素处理下,腋芽中TpMAX1基因的相对表达量变化最为明显,且该基因的表达模式与对应外源激素处理下分枝的表型相反,说明TpMAX1基因不仅与红三叶分枝发育密切相关,且对外源激素的响应也更敏感。3.较FB植株而言,TpMAX1基因在MB各组织部位中均上调表达,在叶片表达水平最高,其次为腋芽和茎,在根中表达量最低。通过PCR法克隆得到编码541个氨基酸,全长1623 bp的TpMAX1基因。生物信息学分析表明,TpMAX1相对分子量为61.38 k D,等电点(PI)为8.62,不稳定系数为38.11,属于稳定蛋白。亚细胞定位预测该蛋白可能位于内质网膜上。二级结构主要由α螺旋(47.13%)和无规则卷曲(37.34%)构成,与其空Periprosthetic joint infection (PJI)间结构预测结果高度一致。系统发育树分析显示,红三叶TpMAX1蛋白与蒺藜苜蓿Mt MAX1及鹰嘴豆Ca MAX1属于同一分支,亲缘关系最近。采用农杆菌介导花序浸染法将重组表达载体PCAMBIA2300-TpMAX1转入野生型拟南芥中,共得到8株转基因拟南芥植株。与野生型拟南芥相比,转TpMAX1拟南芥的分枝数显著低于野生型。4.以岷山红三叶(M)、甘红1号红三叶(G)和红三叶新品系(R)的下胚轴为外植体,分别进行愈伤组织诱导分化,不定芽诱导伸长和生根研究,结果表明:愈伤组织诱导阶段,M的出愈率最高(94.67%),最佳诱导培养基为MS+2 mg/L 2,4-D+0.6 mg/L6-BA;愈伤组织分化阶段,G的芽分化率较高(8.00%),最佳分化培养基为MS+3 mg/L6-BA+0.3 mg/L NAA;生根培养阶段,R的生根率最高(92.33%),最佳生根培养基为1/2MS+2 mg/L IBA。结合3份红三叶材料的出愈率、芽分化率及生根率等各指标得出,甘红1号红三叶的再生能力最强。基于此,以甘红1号红三叶作为遗传转化的受体材料,对其进行农杆菌介导的遗传转化影响因素研究,结果表明:将淡黄色致密愈伤组织用含PCAMBIA2300-TpMAX1质粒的农杆菌菌液OD_(600)值为0.7,侵染20 min,共培养3 d后转入含300 mg/L Cef的筛选分化培养基上可成功诱导出抗性芽。在此基础上,农杆菌介导的红三叶遗传转化体系需要进行更深一步的研究和探讨。