米尔伊丽莎白菌是一种传染性强的病原体,引发蛙的“歪头病”,在蛙类养殖中导致高死亡率,给我国蛙养殖业的经济发展造成了巨大的损失。米购买SAG尔伊丽莎白菌快速灵敏的检测至关重要,在本研究中我们将RPA技术应用于米尔伊丽莎白菌的检测,建立了荧光RPA(exo RPA)和胶体金试纸条RPA(RPA-LFD)两种方法,实现了对米尔伊丽莎白菌的早期检测,是有效控制传染病爆发和传播的手段。通过接种疫苗的方法来防治疾病已成为国内外渔业病害防治研究的热点。本文通过筛选不同的佐剂制备了米尔伊丽莎白菌灭活疫苗为蛙养殖病害防治奠定基础。目前,国内外渔业病害防治大都通过接种疫苗来预防。本文通过筛选不同的佐剂制备了米尔伊丽莎白菌灭活疫苗,为蛙养殖的病害histopathologic classification防治提供了参考数据。主要结果如下:1.筛选引物和探针,建立exo RPA和RPA-LFD方法在本研究中,我们针对米尔伊丽莎白菌的mut T基因,设计了9对引物,其中mut T705/706的扩增效果最好,被选为最佳引物用于后续检测。我们建立了exo RPA和RPA-LFD法检测米尔伊丽莎白菌,可以在38℃下30 min内完成特异性和灵敏性检测。RPA-LFD和exo RPA检测的灵敏限度是10~2copies/μl,比普通PCR检测灵敏10倍。通过检测多个DNA样本(米尔伊丽莎白菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、Cy HV-2和鲶爱德华菌),结果显示该方法仅在米尔伊丽莎白菌DNA样品中显示出目的条带。通过涂布平板法和q RT-PCR法检测组织中细菌载量以确定米尔伊丽莎白菌的靶器官,旨在使exo RPA和RPA-LFD法在实际中的应用更简捷。结果显示脑组织的细菌载量高,是米尔伊丽莎白菌趋向性组织。我们选取脑组织进行早期检测病原。采用PCR、传统RPA、RPA-LFD和exo RPA方法检测了随机选取的24只青蛙,结果显示RPA-LFD和exo RPA方法能够快速准确地检测出米尔伊丽莎白菌。2.米尔伊丽莎白菌灭活疫苗的制备将保存的米尔伊丽莎白菌在BHI培养基中28℃恒温培养24 h,挑取单克隆菌落接种至BHI培养基扩大培养至对数期,在4℃下以5000 r/min离心10 min,收集沉淀,PBS重悬,离心三次,用0.3%甲醛灭活细菌48 h,测定OD值,通过OD值和生长指数制作标准曲线,计算出米尔伊丽莎白菌的半致死浓度,制备米尔伊丽莎白菌的灭活疫苗。3.灭活疫苗联合免疫佐剂在活体中的应用。在本研究中,我们将500只黑斑蛙平均分为10组,一半用于生存率检测,一半用于取样,分别为对照组、疫苗组、疫苗+山莨菪碱组、疫苗+壳聚糖组以及疫苗+β-葡聚糖组。每组浸泡免疫1 h,在7 d后加强免疫浸泡一次,在第15d时进行米尔伊丽莎白菌肌肉注射攻毒检测生存率。结果显示:疫苗+壳聚糖组的保护率为63%,疫苗+山莨菪碱组的保护率为57%,显著高于对照组(17%)。为了探究其保护机制,我们研究了血清酶活、炎症反应、细菌负荷和组织损伤。结果表明,壳聚糖和山莨菪碱可增强疫苗免疫效果,提高血清中SOD、溶LZM和C3的活性。此外,还可以通过快速调动和恢复白细胞水平,有效调节炎症反应,显著降低脑、肝、肾、眼组织的细菌负荷,明显减轻肝、脑、肾、眼组织损伤。由此可见,壳聚糖和山莨菪碱做为免疫佐剂增强了疫苗的免疫调节作用,可有效预防蛙歪头病。这为蛙养殖提供MG132 NMR了防治的初步方案,以降低细菌性疾病对蛙养殖业造成的损失。本研究围绕米尔伊丽莎白菌建立了RPA-LFD和exo RPA两种快速检测方法,证明了其实际应用中的可靠性;并制备了米尔伊丽莎白菌灭活疫苗,验证了灭活疫苗联合免疫佐剂在活体中的浸泡免疫效果,提高了青蛙的免疫效力和生存率。为青蛙养殖和早期检测提供了一定的理论基础和初步的数据参考。