研究背景和目的心血管病已成为导致死亡的首要原因,动脉粥样硬化作为多种主要心血管病的发病基础,对其潜在机制的研究有待继续深入。好发粥样硬化的动脉具有丰富的神经支配,近年来的研究发现神经来源的一些活性成分对动脉粥样硬化也具有直接作用。神经肽Y(NPY)是一种由36个氨基酸组成的神经递质,在周围神经系统,NPY表达于交感神经节,与去甲肾上腺素共同储存、共同释放。人群研究中发现NPY基因多态性与动脉粥样硬化病变程度明显相关,提示NPY在动脉粥样硬化中可能发挥调节作用。但在现有的少量动物实验中,NPY对动脉粥样硬化所发挥的作用存在矛盾,涉及的机制尚不清楚。因此,在本研究的第一部分,我们应用NPY基因敲除小鼠直接研究了NPY缺失对动脉粥样硬化的影响,并利用蛋白质组学分析发掘NPY发挥调节作用的可能机制。作为斑块中的主要效应细胞,巨噬细胞的自噬对斑块形成发挥多重影响。在本研究的第二部分,我们在体外实验研究了NPY对巨噬细胞自噬的作用,探讨NPY调节动脉粥样硬化的细胞机制。课题组在前期研究中发现了弓状核NPY调节交感输出,进而调节外周棕色脂肪产热的神经环路,由此,第三部分研究应用Cre-loxp系统特异性调节转基因小鼠弓状核NPY表达,研究弓状核NPY对动脉粥样硬化的作用,对动脉粥样硬化的中枢调节进行了探索。第四部分则进一步研究了NPY缺失对动脉损伤后内膜增生的作用和机制,探讨NPY在动脉粥样硬化并发症中的作用。实验方法一、首先通过颈动脉套管置入结合高脂高胆固醇饲养的方式在NPY~(-/-)小鼠和野生型对照(WT control)小鼠诱导颈动脉粥样硬化形成。在套管置入高脂高胆固醇饲养12周后,取材小鼠套管段颈动脉进行以下各项实验:1.通过连续冰冻切片和HE染色评价套管近心端边缘以近颈动脉斑块形成情况;2.通过蛋白质组学检测两组小鼠套管段颈动脉的蛋白表达,筛查差异表达蛋白,进行生物信息学分析;并对部分差异表达蛋白的m RNA表达水平进行检测;3.免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞含量;4.实时定量PCR检测病变颈动脉炎症因子,自噬标志物的m RNA表达;5.Western blotting检测病变颈动脉的自噬活化情况。二、给予体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞NPY干预,检测细Secondary hepatic lymphoma胞自噬变化情况。1.给予雷帕霉素激活RAW264.7细胞自噬,并给予NPY孵育,采用Western blotting和免疫荧光染色检测细胞自噬标志物;2.给予NPY作用正常培养中的RAW264.7细胞6小时,Western blotting检测细胞自噬水平BI 10773 NMR;3.给予梯度剂量的NPY作用RAW264.7细胞24小时,CCK8法检测细胞活力;4.实时定量PCR检测NPY作用RAW264.7细胞后,细胞自噬相关分子的m RNA表达。三、首先通过脑立体定位注射将携带Cre基因的腺相关病毒注射到转基因小鼠的弓状核或室旁核,诱导NPY~(-/-)小鼠弓状核NPY恢复表达和Y1R~(flox/flox)小鼠室旁核Y1受体敲除。中枢干预后再给予小鼠高脂高胆固醇饲养和颈动脉套管置入以诱导颈动脉粥样硬化形成。在套管置入后12周,取小鼠套管段颈动脉进行以下各项实验:1.通过连续冰冻切片和HE染色评价中枢干预对小鼠颈动脉粥样硬化形成的影响;2.实时定量PCR检测病变颈动脉炎症因子的m RNA表达情况。四、通过氯GW-572016试剂化铁局部损伤的方式诱导NPY~(-/-)小鼠和野生型对照小鼠颈动脉内膜增生。在损伤后3周,取材小鼠损伤段颈动脉和对侧未损伤颈动脉进行以下各项实验:1.连续冰冻切片和HE染色评价颈动脉损伤后内膜增生情况;2.免疫组织化学染色检测增生内膜NPY表达和巨噬细胞、平滑肌细胞含量;3.实时定量PCR检测损伤段颈动脉炎症介质的m RNA表达情况。实验结果一、1.与野生型(WT)对照小鼠相比,NPY~(-/-)小鼠颈动脉斑块的面积减小[(1.725±0.264)×10~4μm~2在WT小鼠vs(0.891±0.086)×10~4μm~2在NPY~(-/-)小鼠,p<0.05],斑块/中膜比值降低(0.701±0.122在WT小鼠vs 0.355±0.038在NPY~(-/-)小鼠,p<0.05);2.WT小鼠和NPY~(-/-)小鼠套管段颈动脉的蛋白质组学分析,鉴定到1641个蛋白,其中差异蛋白71个;3.NPY缺失时斑块内巨噬细胞含量减低;4.NPY缺失抑制小鼠病变颈动脉炎症因子IL-6,粘附分子ICAM-1、VCAM-1的m RNA表达;5.与WT小鼠相比,NPY~(-/-)小鼠颈动脉自噬标志物LC3Ⅱ出现上调。二、1.雷帕霉素上调RAW264.7细胞LC3Ⅱ,在10~(-6)M NPY存在的情况下,雷帕霉素所诱导的RAW264.7细胞LC3Ⅱ上调受到明显抑制;2.NPY孵育6小时不引起基础状态下巨噬细胞LC3Ⅱ的改变;3.NPY可下调巨噬细胞自噬相关分子Atg5的m RNA表达。三、1.与未接受中枢干预的control NPY~(-/-)小鼠相比,弓状核NPY恢复表达的NPY~(-/-)小鼠颈动脉斑块面积减小,斑块/中膜比值也出现下降;2.在弓状核NPY恢复表达组,病变颈动脉炎症因子IL-1β和粘附分子ICAM-1、VCAM-1的m RNA表达减低;3.与未接受中枢注射的control Y1R~(flox/flox)小鼠相比,室旁核Y1受体敲除组Y1R~(flox/flox)小鼠颈动脉斑块面积增加[(2.103±0.179)×10~4μm~2在Y1R~(flox/flox)小鼠vs(4.315±0.528)×10~4μm~2在Y1R~(flox/flox)+PVN cre小鼠,p<0.05],斑块/中膜比值增大(0.830±0.062在Y1R~(flox/flox)小鼠vs 1.647±0.173在Y1R~(flox/flox)+PVN cre小鼠,p<0.05)。四、1.与WT小鼠相比,氯化铁损伤所诱导的新生内膜面积在NPY~(-/-)小鼠显著减小[(2.562±0.241)×10~4μm~2在WT小鼠vs(1.145±0.156)×10~4μm~2在NPY~(-/-)小鼠,p<0.05],内膜/中膜比也显著下降(1.142±0.091在WT小鼠vs 0.559±0.067在NPY~(-/-)小鼠,p<0.05);2.WT小鼠的左侧损伤颈动脉的增生内膜、中膜和血管周围组织可见NPY组化阳染区域;3.NPY~(-/-)小鼠损伤颈动脉增生的内膜中巨噬细胞含量降低;4.与WT小鼠相比,NPY~(-/-)小鼠损伤颈动脉炎症介质(IL-6,TGF-β1)和粘附分子(ICAM-1)m RNA表达减低。结论1.NPY缺失可抑制小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成,该抑制作用源自病变血管炎症反应的下调和自噬的上调;2.NPY可抑制雷帕霉素诱导的巨噬细胞自噬,但不影响基础状态下巨噬细胞的自噬;3.中枢弓状核NPY对小鼠颈动脉粥样硬化具有抑制作用,该作用可能也通过室旁核Y1受体介导;4.NPY缺失可通过抑制局部炎症反应抑制动脉损伤后内膜增生。