通过基因编辑技术进行DNA序列靶向修饰,是生物体获得新的特征或功能的重要手段之一。而以CRISPR/Cas9系统为基础,衍生的单碱基编辑系统逐渐在基因靶位点修饰领域广泛运用,该系统中切口酶Cas9(nickase Cas9,n Cas9)组分不会导致DNA双链发生断裂,显著降低了编辑过程中DNA片段插入或缺失(Insertion and Deletion,Indels)的发生频率。且单碱基编辑系统优良的生物安全性,使其在治疗生物遗传疾病的研究中备受青睐。而单碱基编辑系统也逐渐成为畜牧业改良家畜动物经济性状的重要分子育种手段。欧拉型藏绵羊是我国特有的绵羊品种,具有生长性能突出、肉质营养丰富与经济价值较高等优点,打造藏绵羊产业,对助力青海省特色农牧业可持续发展具有重要意义。但是藏绵羊生产效率低下,已成为限制其产业发展的最大障碍,且传统育种方法很难快速提高绵羊的产羔数。Fec B与GDF9已被证实是绵羊多胎繁殖的主效基因,Fec B基因编码区存在A746G碱基突变,GDF9基因编码区存在G260A、G721A与G1184T碱基突变,这些突变可以改良藏绵羊的生殖性状,提高藏绵羊的繁殖性能。本试验旨在利用单碱基编辑系统,使藏绵羊成纤维细胞实现Fec B与GDF9基因的靶位点突变,且引入促进同源定向重组(Homology-directedrepair,HDR)DNA修复途径的小分子化合物,期望解决绵羊细胞靶位点编辑效率较低的难题。详细的试验过程及结果如下:(1)针对Fec B靶位点所在基因序列设计向导RNA(Single guide RNA,sg RNA),将sg RNA连接至epi-ABEmax载体;针对GDF9基因G1、G4与G8靶位点分别设计sg RNA,再将各sg RNA连接至epi-BE4max载体。随后利用电击转染技术将各载体转入藏绵羊成纤维细胞。药筛后提取阳性细胞基因组,再利用Sanger测序确定靶位点碱基替换,T-A克隆检验编辑效率。最后预测Fec B基因潜在脱靶位点并检测其基因序列。试验结果表明,epi-ABEmax可介导藏绵羊成纤维细胞Fec B靶位点发生A至G的碱基替换,该位点编辑效率为39.13Baricitinib采购%;epi-BE4max可介导藏绵羊成纤维细胞GDF9基因G1、G4与G8靶位点发生G至A的碱基替换,各位点编辑效率分别为10.53%、26.67%与8%。(2)在epi-ABEmax编辑器介导Feselleck产品c B基因靶位点突变过程中,分别添加Nexturastat A、Ricolinostat、RS-1与SB-505124,检测这些小分子是否能提高藏绵羊细胞与293T细胞Fec B基因靶位点的编辑效率。使用T-A克隆及扩增子测序检验编辑效率,发现Nexturastat A与RS-1小分子化合物可提高藏绵羊成纤维细胞Fec B基因靶位点的编辑效率,其碱基替换频率分别提高了0.61倍与0.39倍;Nexturastat A小分子化合物还可提高239T细胞Fec B基因靶位点的编辑效率,其碱基替换频率提高了0.33倍。(3)在epi-BE4max编辑器介导GDF9基因靶位点突变过程中,分别添加Nexturastat A、Ricolinostat、RS-1与SB-505124,检测这些小分子是否能提高藏绵羊细胞GDF9基因靶位点的编辑效率。使用T-A克隆及扩增子测序检验编辑效率,发现Nexturastat A与SB-505124小分子可提高藏绵羊成纤维细胞GDF9基因G1靶位点的编辑效率,其碱基替换频率分别提高了0.48倍与0.34倍;Nexturastat A与SB-505124小分子还可提高藏绵羊成纤维细胞GDF9基因G4靶位点的编辑效率,其碱基替换频率分别提高了0.37倍与0.36倍。综上,本研究利用单碱基编辑系统在藏绵羊细胞层面上实现了Fec B与GDF9多胎基因的定点突变。利用Sanger测序、T-A克隆及深度靶向测序检测其编辑效率,确定基因编辑类型;还在编辑过程中添加Nexturastat A、Ricolinostat、RS-1与SB-505124四种小分子化合物,并利用扩增子测序biodiesel waste进行效果评估。首次证明Nexturastat A与RS-1可提高藏绵羊细胞Fec B基因靶位点的编辑效率;Nexturastat A与SB-505124可提高藏绵羊细胞GDF9基因靶位点的编辑效率。