目的:肺癌仍是全球发病率和死亡率居于前列的恶性肿瘤。骨骼是肺癌常见的转移部位之一,肺癌一旦发生骨转移,易发生骨相关事件,严重影响患者的生活质量和生存期。肺癌骨转移的机制目前仍不甚清楚。研究发现,肿瘤的去势治疗、卵巢摘除术以及甲状旁腺激素治疗等可加速肿瘤骨转移;肿瘤骨转移治疗中使用破骨细胞抑制剂,如双膦酸盐类药物、地诺单抗等,可延缓肿瘤骨转移的进展,提示破骨细胞活跃在肿瘤骨转移进展中具有促进作用。因此,本研究旨在探讨破骨细胞活跃促进肺癌骨转移的机制。方法:(1)构建体外休眠肺腺癌细胞模型:血清剥夺法诱导肺腺癌细胞株(H1975和A549)休眠,并根据休眠特征采用CCK8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老变化,Western Blot检测休眠相关标志物Nanog、NR2F1、p27、p21的表达情况,验证休眠肺腺癌细胞模型是否构建成功。(2)体外实验证明破骨细胞对休眠肺腺癌细胞的激活作用:体外提取并分离人外周血单个核细胞(Human pmedication knowledgeeripheral blood mononuclear cells,hPBMC),人源M-CSF和h-RANKL重组因子诱导法诱导hPBMC分化为成熟的破骨细胞(Osteoclast,OC),根据细胞免疫荧光染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TARP)染色、骨陷窝吸收实验分别鉴定OC的形态特征、特异性标志物和活性,收集OC的培养上清;将收集的OC上清与休眠H1975细胞共培养24h,收集共培养的H1975用PI染色检测细胞周期变化,细胞增殖示踪荧光探针(CFAD-SE,Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester)染色检测细胞增殖变化,Transwell检测细胞迁移能力,以及Western Blot检测上皮-间充质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)标志物 E-cadherin、N-cadherin 和休眠相关标志物 Nanog、NR2F1、p27、p21 的表达变化,验证OC能否激活休眠肺腺癌细胞。(3)体内实验验证破骨细胞活化可促进肺腺癌细胞增殖:设置实验组(注射鼠源sRANKL组)与对照组(注射PBS组),sRANKL组连续3天腹腔注射sRANKL(每只裸鼠1 mg/kg)于6至8周龄的BALB/C裸鼠,对照组腹腔注射同等剂量的PBS,第4天注射带GFP+-DID+标记的A549细胞(1 × 106cell/只)于裸鼠的胫骨部位,注射细胞96h后采用生物活体成像系统观察肺腺癌细胞分布情况,并分离胫骨中肺腺癌细胞进行流式细胞术检测增殖型肺腺癌细胞的占比情况。(4)OC上清处理休眠肺腺癌细胞前后转录组测序分析的基因表达差异并探寻潜在的作用机制:提取OC上清处理休眠A549细胞24h后的总RNA进行转录组测序,用R软件等对数据进行过滤和差异性分析,GO和KEGG富集分析筛选差异基因参与的细胞功能和信号通路变化,并通过Western Blot初步验证OC上清激活休眠肺腺癌细胞的潜在分子机制。结果:(1)与正常培养相比,血清剥夺组的肺腺癌细胞活性降低,细胞周期停滞在G0/G1期,细胞增殖停滞,细胞未出现凋亡和衰老,休眠相关标志物表达上调,提示血清剥夺法可成功构建休眠肺腺癌细胞模型;(2)人源M-CSF和h-RANKL重组因子诱导法诱ZD1839 IC50导的破骨细胞,免疫荧光结果显示了 OC是包含多个细胞核的巨大细胞,TRAP染色结果显示胞浆呈现紫红色的阳性细胞,且骨吸收陷窝的数目及面积的明显增加,提示人外周血单个核细胞成功诱导为破骨细胞;OC上清处理后,休眠肺腺癌细胞的细胞周期恢复进展,增殖、迁移和EMT都显著增强,同时休眠相关标志物表达下调,提示OC可以激活休眠肺腺癌细胞;(3)注射sRANKL组的动物活体成像结果显示骨中肺腺癌细胞的荧光强度显著高于对照组,流式细胞术检测结果发现注射sRANKL组的裸鼠骨中增殖型肺腺癌细胞的数量显著多于对照组,提示破骨细胞的活化可以促进肺腺癌细胞的增殖;(4)OC上清处理的A549的转录组测序数据分析得到3144个差异基因,其中1592个基因表达上调,1552个基因表达下调;差异基因的GO功能富集显示,差异基因显著富集于细胞外基质的生物学功能,这提示了 OC上清可能介导胞外基质变化影响休眠肺腺癌细胞生长、增殖、迁移和代谢等多种细胞功能;而KEGG信号通路富集分析,OC上清处理后的肺腺癌细胞中上调的基因富集在细胞周期、p53、胞外基质组成等信号通路,而下调的差异基因富CP-456773研究购买集在细胞自噬,胞外连接、mTOR等信号通路;这提示OC上清可通过上调基因或者下调基因激活细胞周期、p53、mTOR等信号通路参与休眠肺腺癌细胞的激活过程。Western Blot结果显示OC培养上清处理后,AMPK去磷酸化和mTOR磷酸化增加,表示肺腺癌细胞中AMPK/mTOR信号通路被激活,提示OC通过激活AMPK/mTOR信号促进休眠肺腺癌增殖和迁移等。结论:破骨细胞可通过激活休眠肺腺癌细胞促进肺腺癌骨转移进展,其分子机制与AMPK/mTOR信号通路可能相关。