食药用真菌是天然活性物质的资源库。灰树花(Grifola frondosa),是一种富含多种营养物质的食药用真菌,且具有多种生物活性。目前,灰树花已被报道具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和降血糖等功效,但对抑菌活性的研究相对较少,缺乏对其抑菌活性物质的深入挖掘、结构解析和抑菌机理研究。本文以灰树花为研究对象,从其液体发酵得到的发酵上清液中分离纯化天然抑菌活性物质,以金黄色葡萄球菌等8株细菌作为实验菌,评估各分离组分的抑菌活性强弱;通过高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术鉴定并验证抑菌活性物质的结构,并对抑菌活性物质的抑菌机理进行探究。同时,为增强灰树花发酵液粗提物的抑菌活性,以发酵液selleck HPLC粗提物作为稳定剂,化学合成得到灰树花纳米硒复合物,其显著增强了灰树花发酵液粗提物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果。主要研究内容与结果如下:(1)对实验室保藏的灰树花菌株进行菌种鉴定,测序结果与NCBI数据库中的样本比对,并构建系统发育树,确定保藏菌株为灰树花。测定发酵过程中黄酮、多酚、多糖以及生物量的变化趋势,确定发酵过程中代谢产物的积累时间为发酵后期(5-10d)。胞外多糖含量在第8 d达到最大值0.263 g·L~(-1),多酚和黄酮含量在第9 d达到最大,分别为0.047和0.039 g·L~(-1),生物量在第9 d达到最大值7.980 g·L~(-1)。(2)将不同发酵天数的发酵上清液冻干浓缩,得到发酵液粗提物。采用微量稀释法比较不同发酵天数的发酵液粗提物对8株实验菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),确定最适的发酵时间。结果表明,第10 d的发酵液粗提物对8株实验菌的抑菌活性最强,其中对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑制效果最为突出,MIC分别为8和32 mg·m L~(-1)。因此,灰树花液体发酵时间确定为10天。(3)发酵液粗提物通过乙醇沉淀,乙酸乙酯和正丁醇逐级萃取,葡聚糖凝胶柱层析以及半制备液相色谱分离等方法得到单一组分的抑菌活性物质I-2。通过超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)分析确定组分I-2的分子量为142,与质谱数据库中的样本数据比较分析确定该化合物为5-羟甲基-2-呋喃甲酸(5-Hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid,HMFCA)。通过比较组分I-2与HMFCA标准品的液相出峰时间,最大吸收波长和质谱碎片信息,确定组分I-2为HMFCA。(4)通过生长曲线、时间-杀菌曲线判断HSecondary hepatic lymphomaMFCA是一种具有时间和浓度依赖性的抑菌活性物质,碘化吡啶染色(pyridine iodide,PI)和冷场发射扫描电子显微镜确定HMFCA是通过破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜,从而抑制或杀死细菌。(5)以灰树花发酵液粗提物作为稳定剂,与硒纳米颗粒(Selenium nanhttps://www.selleck.cn/products/q-vd-oph.htmloparticles,Se NPs)反应成功合成灰树花纳米硒复合物(GF-Se NPs)。GF-Se NPs具有良好的热稳定性,且在4℃避光条件下可稳定保存25天。抑菌实验表明其对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌具有较强的抑菌活性,MIC分别为20和80μg·m L~(-1)。