研究背景桥本甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis,HT,又称桥本病)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyroiditis,CLT),是自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis,AIT)的常见类型。近年来随着人们碘摄入的增多、生活节奏加快等环境因素改变,HT的发病率逐渐升高。大多数HT患者早期缺乏临床表现,有发展为永久性甲减、甲状腺结节甚至甲状腺癌的风险,严重影响患者的生活质量及远期预后。HT发病机理复杂,目前临床尚缺乏特异性的治疗,主要根据患者甲功情况采取甲状腺激素替代治疗,大多数甲功正常、仅相关抗体升高的人群仍停留于被动观察阶段。中医药在治疗HT方面积累了一定经验,在辨证论治、缓解症状、调节免疫、改善甲功等方面疗效确切,值得进一步研究。但目前HT的中医辨证缺乏统一性,领域内没有合适的算法来探索HT证型与临床特征之间的关联规则;此外临证治疗HT的有效中药处方的作用机制尚不明确。因此,本研究依托国家自然科学基金(项目批号:82074412)探索HT证型诊断模型,通过动物实验研究中药治疗HT的疗效及作用机制,为HT的中医诊断及中药治疗提供借鉴和科学依据。研究目的1.利用XGBoost算法构建HT证型诊断模型,并探索证型分类的特征变量。2.通过网络药理学,探讨有效中药处方夏朴消瘿方的有效成分,治疗HT的潜在靶点及潜在作用机制。3.通过动物实验,观察夏朴消瘿方治疗HT的效果及作用机制。研究方法1.纳入病例组HT患者141例,对照组非HT人群236例,采集受试者的甲功指标、甲状腺彩超指标、症状、舌脉等信息,利用XGBoost算法构建HT的中医证型诊断模型,以预测精确度、变量重要性排序、混淆矩阵等评价模型性能。2.利用TCMSP获取夏朴消瘿方有效成分,通过Uniprot蛋白质数据库进行信息标准化处理,通过GeneCards、OMIM,DrugBank及PharmGkb数据库搜集HT疾病相关基因;利用STRING构建蛋白互作网络,筛选夏朴消瘿方治疗HT的潜在靶点;采用Cytoscape 3.7.2构建化合物-靶点网络。通过DAVID进行GO功能及KEGG通路富集分析,获取潜在通路。3.将6-8周龄的雌性SPF级SD大鼠54只随机分为正常组(9)、模型组(45),模型组采用猪甲状腺球蛋白混合弗氏佐剂免疫注射联合高碘喂养,成模后分为模型组、中药高剂量组(中药液17.24g/Kg/d)、中药中剂量组(中药液8.62g/Kg/d)、中药低剂量组(中药液4.31g/Kg/d)、雷公藤多苷组(雷公藤多苷片溶液6.35mg/Kg/d)灌胃,给药体积均为0.908mL/100g,正常组、模型组给予同等体积蒸馏水。干预8周后处死动物并留取样本,通过血清甲状腺功能检测、光镜、透射电镜等方法观察夏朴消瘿汤对大鼠甲状腺形态结构及功能的影响,采用RT-PCR、Western Blot、化学荧光法和ELISA等技术,探讨夏朴消瘿方是否通过调控大鼠体内miR-423-5p介导的NOX4/ROS/NF-κ B通路影响甲状腺滤泡细胞焦亡,从而发挥治疗作用。研究结果1.①分析本研究纳入的病例组及对照组的临床特征,认为性别、TPOAb、TGAb、TSH、FT4、TRAb水平、甲状腺左叶宽度、甲状腺左叶厚度、甲状腺右叶厚度、甲状腺峡部厚度及颈部淋巴结大小在两组间存在差异(P<0.05);病例组主观症状出现频次最高的为乏力、口干、失眠多梦、畏寒肢冷和便溏,舌脉信息出现频次最高的单一诊察内容分别为舌淡红、舌体正常、舌苔薄、舌下脉络正常、脉弦;比较病例组内肝郁脾虚证、气郁痰阻证、心肝火旺证、痰瘀互结证、气阴两虚证及脾肾阳虚证患者的临床特征,认为TSH水平在不同证型间存在差异(P<0.05),但甲功状态(甲功正常、临床甲减、亚临床甲减、甲亢、亚临床甲亢)与证型之间不存在关联(P>0.05)。②XGBoost算法对输出证型分类的变量重要性排序结果为TPOAb、少气懒言、TGAb、下肢浮肿、面色晄白、口渴喜饮、腹胀、便溏、腰膝酸软、咽部异物感、头晕、痰多、便秘、甲状腺左叶宽度、形体消瘦medical liability、病情随情绪增减、畏寒肢冷、乏力、TSH水平、TT3水平、口苦、性别、FT4水平、甲状腺漫肿,无结块,按之柔软、舌体。XGBoost算法建立的HT证型诊断模型的准确率=0.99,对非HT诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT肝郁脾虚证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT气郁痰阻证诊断的精确率=1.00,召回率=0.83,F1值=0.91;对HT心肝火旺证诊断的精确率=0.97,召回率=1.00,F1值=0.98;对HT痰瘀互结证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00;对HT气阴两虚证诊断的精确率=0.98,召回率=1.00,F1值=0.99;对HT脾肾阳虚证诊断的精确率=1.00,召回率=1.00,F1值=1.00。总体模型准确率高,性能好,研究所纳入的临床特征与最终的证型诊断之间存在较强的因果逻辑。2.①夏朴消瘿方治疗HT的核心有效成分包括β-谷甾醇、黄芩苷、黄芩素、槲皮苷、异鼠李素等,可以发挥抗氧化、抗炎免疫等作用。②夏朴消瘿方治疗HT 可能通过调节 PTGS2、ESR1、ESR2、CASP8、STAT3、BCL2、IL1B 等靶标,参与免疫调节、细胞焦亡、炎症反应等。③夏朴消瘿方目前主要作用于Th17细胞分化通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路等,影响活性氧代谢过程、脂多糖反应等生物过程,涉及膜筏、膜微区等细胞成分,影响细胞因子受体结合、血红素结合等分子功能。3.①猪甲状腺球蛋白混合免疫佐剂结合高碘喂养的实验性自身免疫甲状腺炎大鼠(experimental autoimmune thyroiditis rats,EAT)造模成功,模型组大鼠血清TPO-Ab、TG-Ab、TSH、FT3及FT4水平较正常组升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组、中剂量组、雷公藤多苷组血清TPO-Ab、TG-Ab、TSH、FT3及FT4水平均降低(P<0.05);低剂量组血清FT3水平降低(P<0.05),TPO-Ab、TG-Ab、TSH及FT4水平均降低,但与模型组的差异无统计学意义。病理形态方面,HE染色显示模型组大鼠甲状腺滤泡破坏,腺体较多的淋巴细胞浸润,间质可见纤维增生及坏死的细胞;电镜结果显示模型组大鼠甲状腺滤泡细胞及细胞器结构破坏,呈焦亡的形态特征,在中药及雷公藤多苷干预后,大鼠甲状腺损伤及甲状腺滤泡细胞焦亡均得到不同程度的改善。②模型组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.05),高剂量组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较模型组下调(P<0.01),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺GSDMD的mRNA表达较模型组均下调,但未见统计学差异;模型组大鼠甲状腺GSDMD的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺GSDMD的蛋白表达较模型组均下调(P<0.05)。模型组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺NLRP3的mRNA表达较模型组均下调,但差异无统计学意义;模型组大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组、中剂量组、雷公藤多苷组大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01),低剂量组大鼠大鼠甲状腺NLRP3的蛋白表达较模型组下调,但差异无统计学意义。模型组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量、中剂量、雷公藤多苷组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01),低剂量组大鼠甲状腺Caspase-1的mRNA表达较模型组下调,但未见统计学差异;模型组大鼠甲状腺Caspase-1的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺Caspase-1的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。模型组大鼠甲状腺ASC的mRNA表达较正常大鼠上调,但差异无统计学意义,高剂量组大鼠甲状腺ASC的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组鼠甲状腺ASC的mRNA表达较模型组下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺ASC的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺ASC的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。模型组大鼠甲状腺IL-18的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺IL-18的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠甲状腺IL-18的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺IL-18的蛋白较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠血清IL-18水平与正常组相比无统计学差异,与模型组相比,各干预组的IL-18水平变化均未见统计学差异。模型组大鼠甲状腺IL-1β的mRNA表达较正常大鼠上调,但差异未见统计学意义,各干预组大鼠甲状腺IL-1 β的mRNA表达较模型组均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺IL-1 β的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.05),各干预组大鼠甲状腺IL-1β的蛋白表达较模型组均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠血清IL-1β含量较正常组增加(P<0.01),高剂量组、中剂量组及雷公藤多苷组大鼠血清IL-1β水平较模型组均下降(P<0.05),低剂量组血清IL-1 β水平较模型组均下降,但差异无统计学意义。③模型组大鼠甲状腺组织的miR-423-5p的表达水平较正常组下调(P<0.05),与模型组相比,各干预组甲状腺组织的miR-423-5p的表达均上调,但差异无统计学意义;模型组大鼠甲状腺NOX4的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺NOX4的mRNA表达较模型组均下调(P<0.01);模型组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组、中剂量组和雷公藤多苷组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)),低剂量组大鼠甲状腺NOX4的蛋白表达较模型组下调,但差异无统计学意义。模型大鼠甲状腺ROS含量较正常大鼠增加(P<0.01);与模型组相比,各干预组大鼠甲状腺ROS含量降低(P<0.01),低剂量组大鼠甲状腺ROS含量下降,但与模型组相比未见统计学差异。模型组大鼠甲状腺NF-κ B的mRNA表达较正常大鼠上调(P<0.01),高剂量组大鼠甲状腺NF-κB的mRNA表达较模型组下调(P<0.05),中剂量组、低剂量组及雷公藤多苷组大鼠甲状腺NF-κ B的mRNA表达与模型组相比均下调,但差异未见统计学意义;模型组大鼠甲状腺NF-κB的蛋白表达较正常大鼠上调(P<0.01),各干预组大鼠甲状腺NF-κ B的蛋白表达较模型组均下调(P<0.01)。研究结论1.患者的主、客观临床特征在HT不同证型间存在共性和差异,XGBoost算法能够获取中医证候分类的特征变量及客观规则,建立具有准确性和可点击此处解释性的HT证型诊断模型。本研究的模型对HT辨证分类的特征重要性排序前五位为:TPOAb、少气懒言、TGAb、下肢浮肿、面色晄白,临证中可重点关注以上特征,予以相应的诊疗措施。2.夏朴消瘿方能多成分、多靶点、多途径协同治疗HT,其干预机制主要涉及活性氧代谢、炎症反应、免疫调节及细胞焦亡等。3.夏朴消瘿方能有效改善EAT大鼠的甲功及甲状腺自身抗体水平,减轻甲状腺病理损伤,保护甲状腺滤泡细胞。夏朴消瘿方通过上调EAT大鼠甲状腺miR-423-5p的表达,负向调节NOX4/ROS/NF-K B信号通路,从而调控NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡及后续的炎症应答,降NSC 119875低EAT大鼠体内焦亡相关靶点 NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD 及炎症因子 IL-18、IL-1 β的表达,发挥治疗HT的作用。