目的本研究通过网络药理学方法预测木丹颗粒防治糖尿病肾损伤的核心成分和核心靶点,并通过动物实验验证木丹颗粒对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及相关机制,为扩大其临床适应证提供科学依据。方法1、网络药理学:通过中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)查找并筛选木丹颗粒的活性成分,并从中医药综合数据库(TCMID)和文献中予以补充,最终得到木丹颗粒中的活性化合物,经过Swiss ADME筛选后的有效活性成分通过Swiss target prediction数据库预测其对应靶点。通过Gene Cards数据库和OMIM数据库挖掘糖尿病肾损伤的潜在靶点。利用Venny 2.1.0获取木丹颗粒与糖尿病肾损伤的交集靶点利用STRING 11.0数据库构建蛋白质-相互作用(PPI)网络模型,并通过Cytoscape 3.8.0中进行拓扑学参数分析。将木丹颗粒与糖尿病肾损伤交集靶点上传至注释、可视化和集成FG-4592生产商发现数据库(DAVID)数据库中进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并将结果利用在线微生信对数据进行可视化。2、动物实验(1)造模:50只SD大鼠随机抽取5只作为空白对照组,其余大鼠一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L,p H 4.5)新鲜配置的STZ(65 mg/kg)缓冲溶液。72h后测得血糖值≥16.7mmol/L的大鼠为糖尿病大鼠。(2)分组:正常大鼠为空白对照组(Control),造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组(Model)、木丹颗粒低剂量组(MD-L)、木丹颗粒中剂量组(MD-M)、木丹颗粒高剂量组(MD-H)maternal medicine和阳性药对照组(Val)。(3)给药:阳性药对照组(缬沙坦8.23mg/kg)、木丹颗粒低(1.08g/kg)、中(2.16g/kg)、高剂量(4.32g/kg)组给予相应剂量药物,模型组和空白对照组大鼠给予相同体积的蒸馏水,连续灌胃给药12周。(4)检测指标:给予木丹颗粒后记录各组大鼠的摄食量、饮水量、体重、空腹血糖(FBG)以及随机血糖;12周后,收集大鼠24h尿液和血清,利用试剂盒测定尿液中24h尿蛋白水平以及血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量;苏木素-伊红(HE)染色和过碘酸雪夫(PAS)染色观察肾组织病理形态学变化;酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清中炎症因子水平,包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及IL-6;蛋白质免疫印迹(WB)法检测大鼠肾脏组织PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达情况。结果1、网络药理学:筛选出木丹颗粒的活性成分174个,其中防治糖尿病肾损伤的核心活性成分22个,包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素与甘草查尔酮A等;木丹颗粒防治糖尿病肾损伤的核心靶点基因有24个,包括PTGS2(蛋白名:过氧化物合酶2,COX-2)、RELA(蛋白名:核因子κB,NF-κB p65)、AKT1(蛋白名:蛋白激酶B,Protein Kinase B,AKT)、MAPK1(蛋白名:细胞外信号调节激酶2,ERK2)、TNF(蛋白名:TNF-α)等,涉及到药物的反应、凋亡的负调节和RNA聚合酶II启动子转录的正向调节等生物过程。KEGG共富集到126条信号通路,包括胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)-蛋白激酶(AKT)、TNF、缺氧诱导因子-1(HIF-1)与T细胞受体信号通路等。2、动物实验与空白对照组相比,模型组大鼠体重显著降低,摄食量、饮水量有所增加,血糖明显升高(P<0.01),24h尿蛋白显著增加,血清中血肌酐和尿素氮含量明显升高(P<0.01);与模型组相比,木丹颗粒中、高剂量组24h尿蛋白明显降低(P<0.01),木丹颗粒中、高剂量组和缬沙坦组血肌酐水平降低(P<0.05),各给药组血清尿素氮水平均明显降低(P<0.01)。与空白对照组相比,模型组大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C水平明显升高,HDL-C水平明显下降(P<0.01);木丹颗粒低、中、高剂量以及缬沙坦药物干D-Lin-MC3-DMA生产商预12周之后,糖尿病大鼠血清T-CHO、TG水平均下降(P<0.05),木丹颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠血清LDL-C水平下降(P<0.05),木丹颗粒中剂量组大鼠血清HDL-C水平升高(P<0.05)。与空白对照组相比,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低(P<0.01),木丹颗粒中剂量组大鼠血清IL-1β水平下降(P<0.05),木丹颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠血清IL-1β水平明显下降(P<0.01)。与空白对照组比较,模型组大鼠肾脏组织中p-PI3K、p-AKT表达明显下降(P<0.01),p-NF-κB p65表达明显上调(P<0.01);与模型组比较,木丹颗粒和缬沙坦均能上调大鼠肾脏组织中p-PI3K、p-AKT的表达(P<0.05),下调p-NF-κB p65的表达(P<0.05)。结论木丹颗粒对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用,其机制可能与激活PI3K/AKT通路,从而抑制NF-κB p65的磷酸化,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,发挥抗炎作用有关。