研究背景心肌炎是一种由多种因素引起的心肌组织炎症性疾病,是儿童和青少年常见的心血管疾病之一,暴发性心肌炎(Fulminant myocarditis,FM)是儿童心肌炎中最严重的一类,其起病急,病情重,常可因高度破坏性的心力衰竭、血流动力学严重改变、心源性休克以及并发的多器官功能衰竭而导致死亡。据报道,在儿童急性心肌炎中,MK-4827体内FM占比高达38%,死亡率高达48%,严重危害儿童健康,现已发现免疫反应失调、炎症因子风暴以及病原微生物直接侵犯心肌细胞在暴发性心肌炎的发生发展中发挥重要作用,但其具体的分子机制尚未完全阐明。信使RNA(mRNA)是一种指导蛋白质合成的单链RNA,是生物体中唯一的编码RNA,可将DNA中的遗传信息与蛋白质的翻译和表达联系起来,在多种生命活动中发挥重要作用。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸序列的非编码RNA分子,因其具有复杂的二级和三级结构,可与RNA、蛋白质等多种物质结合,发挥丰富的生物学功能。研究发现,mRNA和lncRNA异常表达与心肌细胞的增殖分化、心脏重构、心脏应激及免疫调节等多种心血管疾病的病理生理过程密切相关,除了调节细胞内的功能外,mRNA和lncRNA还可以释放到细胞外环境中,作用于临近细胞或Short-term bioassays远端细胞发挥作用,也可存在于体液循环中成为疾病潜在的诊断标志物。循环中的RNA与小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles,sEVs)密切相关。sEVs是一类由多种细胞产生的直径小于200nm的脂质双层膜结构的囊状小泡,其携带的mRNA和lncRNA可在细胞通讯间通讯及动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压、心力衰竭等心血管疾病中发挥重要调节功能,但其在儿童心肌炎中的研究尚未见报道。目的寻找FM患儿和健康对照儿童血浆中差异表达的小细胞外囊泡mRNA(sEVs-mRNAs)和lncRNAs(sEVs-lncRNAs),并对差异表达的sEVs-mRNAs及sEVs-lncRNAs进行功能富集分析并进一步分析其在FM发病机制特别是免疫调节机制中潜在的作用。从血浆小细胞外囊泡中的mRNA和lncRNA出发,为FM的发病的分子机制提供新的研究思路。方法1.本研究共收集了2021年1月15日到2022年5月20日在山东省立医院儿科就诊的15例暴发性心肌炎患儿及15例年龄与性别相仿的健康志愿者的外周血血浆,使用差速离心法提取sEVs,透射电镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)及Western blot对sEVs进行表征。2.选取5例FM患儿和5例健康对照儿童的血浆sEVs,提取其总RNA,并采用Illumina NovaSeq 进行 RNA 测序,筛选差异表达的 sEVs-mRNAs 和 sEVs-lncRNAs 并进行功能富集分析.3.使用String对差异表达的mRNA进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析并使用Cytoscape 3.9.1对网络进行可视化。使用CytoHubba插件中的5种算法(DMNC、MCC、MNC、EPC和Degree)来计算前10位基因,取交集基因作为核心基因,并使用GeneMANIA数据库预测与核心基因相互作用的基因,Metascape数据库对相互作用基因进行功能注释。4.筛选出与免疫调节相关的差异lncRNA,预测其潜在的免疫调节功能,之后选取起核心作用的lncRNAs分子,通过qRT-PCR进行差异表达验证并进行临床相关性分析。结果1.经全转录组测序分析,按照差异倍数2倍以上,且P<0.05的标准,共检测到194个差异表达的sEV-mRNAs(152个上调,42个下调),79个差异表达的 sEVs-lncRNAs(68 上调,11 个下调)。2.富集分析的结果表明,血浆sEVs中差异表达的mRNA和lncRNA相关的靶基因,与免疫、凋亡以及蛋白质外排等相关信号通路改变相关,也与FM相关的免疫功能紊乱密切相关。3.通过String数据库对差异表达的sEV-mRNAs进行相互作用网络分析,并通过多种算法筛选出了 3个在相互作用中起核心作用的mRNA,包括YWHAH、AXIN1和CSNK1A1。功能富集分析结果显示,这三个核心基因及其相互作用基因主要富集在Wnt信号通路相关过程、磷酸丝氨酸残基结合、蛋白质的泛素化调节、膜电位调节及细胞迁移的正向调节等与FM密切相关的生物学过程中。4.进一步筛选并分析免疫相关的lncRNA靶基因,发现其主要富集于免疫系统激活、巨噬细胞趋化和极化相关信号通路与生物学过程,与FM中免疫调节机制密切相关。5.qRT-PCR结果显示NONHSAT144744.2的表达水平与测序结果一致且差异具有统计学意义,且其相对表达水平与心肌炎临床指标超敏肌钙蛋白T(Hs-TnT)和B型脑钠肽(BNP)呈正相关,与左室射血分数(LVEF)呈负相关。结论1.暴发性心肌炎患儿血浆小细胞外囊泡中mRNA和lncRNA的表达与健康对照儿童具有明显差异,功能富集分析结果显示这些差异表达的mRNA和lncRNA分子可能参与暴发性心肌炎病程进展中的免疫调节过程。2.在差异表达的血浆sEVs-mRNAs的相互作用网络中,起核心作用的是YWHAH、AXIN1和CSNK1A1,可在免疫、炎症及病毒感染等多种与暴发性心肌炎相关的生物学过程中发挥作用,可能成为FM潜在的诊断标志物和治疗靶点。3.血浆sEVs-lncRNA可能通过调节免疫细胞的迁移及分化,参与调节FM的发生和发展4.NONHSAT144744.2在暴发性心肌炎患儿的血浆小细胞外囊泡中的表达水平显著增高,可能通过调节RSL3抑制剂MAVS基因的表达,调控靶细胞的抗病毒反应。