腈类化合物在很多领域都发挥着重要的作用,而传统合成腈的方法大多存在不足,如反应过程中涉及剧毒金属氰化物或HCN,从而引发的严重安全隐患。为此,本研究开发了安全、高效且条件温和的化学-酶法合成腈类化合物。基于醛肟脱水酶的催化特性,以醛和胺为底物,经历醛肟中间体,催化合成腈类化合物。为了提高醛肟脱水酶的催化性能,采用半理性设计策略,对结合口袋和底物通道中关键氨基酸进行突变,筛选出最佳突变体。同时,设计特定的标签肽段,通过谷氨酰胺转胺酶(MTG)介导的生物正交方法,将醛肟脱水酶聚合体共价固定在树脂上,实现“一步法”聚合-纯化-固定目标酶蛋白,提升其工业应用前景。首先,通过基因组挖掘策略筛选获得来源于霉菌Aspergillus ibericus CBS121593基因组中的醛肟脱水酶Oxd Asp。选择p ET28a构建重组质粒,在E.coli BL21(DE3)中实现功能表达。以肉桂醛肟(Cin Ox)为底物对重组Oxd Asp的酶学性质进行了表征,其最佳反应温度为30℃,最适反应p H为6.0,在30和35℃下的半衰期分别为3.5 h和1.6 h。以Cin Ox底物,其K_m和V_(max)分别被确定为3.55m M和1.54μmol min~(-1)mg~(-1)。通过selleckchem CCRG 81045多序列比对,Oxd Asp已报道的醛肟脱水酶序列同源度,约20～30%,且不具备传统的催化三联体。同时,构建Oxd Asp同源结构模型,并将Cin Ox对接入催化口袋,考察底物结合情况。基于关键残基的丙氨酸扫描,进一步预测了Oxd Asp的催化机理。底物进入催化口袋后,羟基被Glu192固定,相邻的Arg141极化Tyr138中的酚基质子,然后质子化的Tyr138捐献一个质子脱去醛肟中的水分子后产生腈。其次,对Pseudomonas putida F1中的Oxd F1进行半理性的蛋白质设计,构建一种化学-酶顺序催化苄胺合成芳香腈化学品。通过基于蛋白质结构的CAVER分析表明,Met29、Ala147、Phe306和Leu318位于Oxd F1底物隧道入口附近,Leu145的疏水侧链可能会影响催化袋中底物的结合方向。经过两轮突变,突变体L318F和L318F/F306Y对苯甲醛肟的催化活性显著提高,约2.86μmol min~(-1)mg~(-1)。同时,来自Candida antarctica lipase type B的CAL-B在E.coli中功能表达,以UHP作为反应体系中的氧化剂,选择性地将苄胺氧化为醛肟,并优化了该选择性氧化反应。最佳反应条件为在Et OAc溶剂中,6 mAMG510g冻干的全菌体细胞以及2倍当量UHP,在7 h内转化率约为91%。又通过使用含有50 m M无水Na_2SO_3的水溶液(氧化反应体积的1/5)还原方法,组合氧化和脱水两个反应过程,催化苄胺合成芳香腈化学品。对于不同的底物,无需分离中间体,可获得约60%的产率。最后,使用MTG介导的生物正交方法,将Oxd F1聚合后共价固定在树脂上,提升酶蛋白的工业应用属性。重组大肠杆菌K-Oxd F1-L318F-Q,在MTG的催化下两个残基之间优先发生分子内交联,酶活力并未得到提高。重组大肠杆菌K-Oxd F1-L318F-K和Q-Oxd F1-L318F-Q,在MTG的催化下聚集,酶活力得到明显的提高,约6.89 U/mg。综上所述,本文基于醛肟脱水酶的催化特性,成功开发了从胺和醛出发合成腈的化学酶合成方法。该方法为高效、稳定合成腈提供了思路,持续推进高附加值腈化学品的绿色制造技术升级和迭代。同时,通过半理性蛋白设计和共价固定化提高了醛system medicine肟脱水酶的催化性能,为酶的定向改造提供了参考,加快了酶工业化的脚步,具有较高的理论意义和应用价值。