痴呆症是指由各种原因引起的认知功能丧失或下降的总称。血管性痴呆(vascular dementia,VD)是痴呆症患者数量第二的疾病,占全部痴呆病例的10-20%,仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)。据流行病学统计,预计到2030年全世界大约将会有1320万VD患者,到2050年这一数字将达到2300万,这无疑为社会及个人都带来了巨大的负担。而目前,尚缺少VD的有效治疗手段及药物。VD是一种由脑血管病变或脑血管病相关危险因素引起的认知功能障碍。脑灌注不足会促使星形胶质细胞和小胶质细胞等中枢神经系统免疫细胞增生,释放炎症因子,引起神经炎性反应,继而促使神经元出现凋亡、自噬等生理反应,最终导致神经元死亡,海马结构受损。海马是大脑记忆及空间认知的重要组织区域,其损伤会导致认知功能下降。故此,减少海马区胶质细胞增生,减轻神经元凋亡及自噬是神经保护的一种方式。而PI3K/Akt/m TOR信号通路是调节细胞凋亡及自噬的重要通路之一,证实该通路参与多种神经疾病的相关文献有很多,但因为其关联的信号分子复杂,目前仍需更多实验来进一步研究。度拉糖肽是一种新型的降糖药物,能激动胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)。从以往的研究可以得出结论,度拉糖肽可以改善胰岛素抵抗,是良好的降糖药物,且在神经系统疾病中也有一定作用。而度拉糖肽在VD中的相关研究尚未见报道。因此,本实验中我们探讨度拉糖肽是否可以改善VD的认知障碍。临床部分探讨甘油三酯葡萄糖乘积(triglyceride-glucose,Ty G)指数是否与认知功能障碍风险增加相关,也就是明确胰岛素抵抗与认知障碍是否相关。基础实验部分将通过双侧颈总动脉结扎(Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)的方法建造VD大鼠模型,应用高、中、低三种不同剂量的度拉糖肽进行干预,并监测大鼠的血糖及体重变化。用药4周后应用Morris水迷宫及旷场实验进行行为学测试。测试完成后取材,通过免疫荧光、western blotting、RNA-Sequencing技术检测各组海马区神经元及胶质细胞变化,细胞凋亡、自噬和PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白及基因表达水平。从而探讨度拉糖肽成为VD治疗候选药物的可能性。第一部分甘油三酯葡萄糖乘积指数与中老年人群认知功能损害相关影响的临床研究目的:探讨Ty G是否与认知功能障碍风险增加相关。方法:本研究回顾性收集了2018年1月至2021年12月就诊于河北省人民医院,并完善了认知功能评估的无既往糖尿病病史患者,共134人。患者入组后收集患者一般情况及患者实验室血液检测指标,如空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、尿酸和血清总同型半胱氨酸等。通过空腹甘油三酯及空腹血糖计算Ty G指数,并收集其蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment,Mo CA)评估结果。数据处理采用SPSS 23.0统计软件,计量资料由均值±标准差表示,分类资料由百分数表示,比较组间差异使用独立样本t检验,组间差异使用卡方检验比较。应用多因素二元logistic回归分析确定认知功能障碍风险影响因素。结果:1.本回顾性研究纳入134名符合条件的患者,平均年龄62.4±10.7岁,男性占56%(n=75)。根据Mo CA评分将所有患者分为非认知障碍组(n=45)及认知障碍组(n=89)。相比非认知障碍组,认知障碍组患者年龄偏大、高血压患病率更高、出现颅内斑块可能性更大(P<0.05),值得注意的是,认知障碍组的Ty G指数显著高于非认知障碍组(P<0.01)。2.在单因素二元logistic回归分析中,Ty G指数升高与认知障碍相关(OR:6.87;95%CI:2.30-20.55;P<0.05)。在多因素二元logistic回归分析中,这种相关性仍然显著,在调整年龄、高血压病史、颅内动脉硬化后,增高的Ty G指数仍与患者认知障碍的风险相关(OR:6.04;95%CI:1.49～24.46;P<0.01)。而年龄无论在单因素回归分析(OR:1.05;95%CI:1.01-1.10;P<0.05)还是多因素回归分析中(OR:6.87;95%CI:2.30-20.55;P<0.05)也均与认知障碍显示了强相关性。3.为进一步明确Ty G指数是否为认知障碍的独立危险因素,以认知障碍与否作为因变量,分别纳入一般情况及实验室指标数据进行多因素二元logistic回归分析,结果显示Ty G指数是认知障碍发生的独立危险因素(P<0.05)。小结:Ty G指数水平与中老年患认知障碍的风险呈正相关。年龄也是罹患认知障碍的风险因素之一。第二部分度拉糖肽对血管性痴呆大鼠血糖、体重及认知功能的影响目的:通过BCCAO的方式建立大鼠VD模型,观察度拉糖肽对术后4周大鼠血糖、体重及认知功能的影响。方法:选用220-250 g清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠进行旷场实验,筛选情绪稳定的大鼠随机分为Sham、Model、Low、Middle、High共5组,除Sham组外行双侧颈总动脉结扎结扎造模,度拉糖肽治疗组应用高、中、低三种不同剂量的度拉糖肽进行腹腔注射4周。具体分组如下:Sham组(假手术+生理盐水注射);Model组(BCCAO手术+生理盐水注射);Low组(BCCAO手术+0.15 mg/kg/week度拉糖肽);Middle组(BCCAO手术+0.3 mg/kg/week度拉糖肽);High组(BCCAO手术+0.6 mg/kg/week度拉糖肽)。注射度拉糖肽期间监测大鼠的血糖及体重变化,用药4周后应用Morris水迷宫及旷场实验进行行为学测试,以期明确度拉糖肽可否减轻VD大鼠认知功能障碍。结果:1.所有大鼠造模术后每3天记录一次体重。在所有组别中,平均体重均随着时间的推移呈上升趋势。而度拉糖肽在测量时间段内并没有体现出明显降低体重的效果。2.我们记录了所有组大鼠手术开始、2周和4周后的空腹血糖。实验记录期间空腹血糖的平均水平在各组间无差异。3.旷场实验中,各组之间在总距离、中心区域穿越次数、静止时间比、站立行为次数、洗脸事件次数和中心区域路程比方Acute respiratory infection面没有均明显差异。与Sham组的大鼠相比,度拉糖肽组的大鼠在旷场实验测试中的行为没有明显变化,度拉糖肽药物治疗并没有引起大鼠更多的焦虑或抑郁样行为。4.Morris水迷宫定位航行实验中,在第2至5天,Model组的逃逸潜伏期明显长于Sham组(第2天:P<0.05;第3至5天:P<0.01),而度拉糖肽治疗组的逃逸潜伏期明显优于Model组(第3天:P<0.05,Middle组vs.Model组;第4天:P<0.01,High组vs.Model组;第5天:P<0.01,所有剂量度拉糖肽治疗组vs.Model组)。度拉糖肽治疗组之间的逃逸潜伏期没有明显差异。总的来说,各组的逃逸潜伏期随着训练时间的增加而逐渐减少。5.Morris水迷宫在空间探索实验中,Sham组和度拉糖肽治疗组的大鼠在目标象限的时间均比Model组的大鼠长(P<0.05,Sham组、Low组、Middle组vs.Model组;P<0.01,High组vs.Model组),五组之间的平台穿越频率没有差异。小结:1.本实验中,应用度拉糖肽的VD大鼠在治疗时间内未见低血糖及明显的体重下降。2.度拉糖肽可以改善VD大鼠的认知障碍,具有神经保护功能。3.本实验中,度拉糖肽没有诱导VD大鼠出现焦虑或抑郁样情绪。4.度拉糖肽高、中、低三个剂量组在水迷宫及旷场实验中未见明显区别。第三部分度拉糖肽对血管性痴呆大鼠海马区神经元及胶质细胞的影响目的:明确度拉糖肽对VD大鼠星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的影响。方法:将第二部分实验处理后的大鼠一部分行灌流及冰冻切片,另一部分大鼠断头留取海马组织。选取大鼠脑冰冻切片予以HE染色,以观察大鼠海马CA1及CA3区结构变化,并通过星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物Iba1和神经元特异性核蛋白Neu N的免疫荧光定量神经胶质细胞及神经元的数量,并通过western blotting技术检测VD大鼠海马中Iba1、GFAP和GAD67的蛋白表达。结果:1.HE染色中,Sham组大鼠的海马CA1和CA3区的神经元排列规则,形态正常,大小适中,细胞核清晰,细胞质排列致密。相反,Model组的神经元丢失,排列紊乱,形态和大小不规则,细胞核和细胞质之间的界限不明显,细胞质松散。三组度拉糖肽治疗大鼠的神经病理变化和神经元损伤均得到明显改善,表明度拉糖肽对VD的神经元损伤有保护作用。2.实验中我们通过Iba1免疫荧光标记对海马的小胶质细胞数量进行了量化。结果显示,Model组海马CA1、CA3和DG区的Iba1+细胞数量明显高于Sham组(三个区域:P<0.01),表明VD大鼠海马所有三个区域的小胶质细胞被广泛激活。相反,度拉糖肽治疗组海马CA1、CA3和DG区的Iba1+细胞与Model相比明显减少(三个区域:P<0.01,所有度拉糖肽处理组vs.Model)。在度拉糖肽治疗的三个不同剂量组中,高剂量组与中剂量组相比,海马CA3区的Iba1+细胞数量明显减少(CA3区:P<0.01,High组vs.Middle组)。此外,我们还应用了western blot技术测定了各组大鼠海马Iba1的蛋白水平。Model组的Iba1蛋白水平明显高于Sham组大鼠(Iba1的蛋白水平:P<0.01),且在各度拉糖肽治疗组中也观察到相对低的Iba1水平(Iba1的蛋白水平:P<0.01,Low组vs.Model组,P<0.05,Middle组和High组vs.Model组)。3.我们进行了免疫荧光定量计数和western blotting蛋白质定量检测实验各组大鼠海马的星形细胞表达。与Sham组相比,未经治疗的VD大鼠在海马的CA1、CA3和DG区域的GFAP+细胞数量明显增加(三个区域:P<0.01)。度拉糖肽的治疗减少了GFAP+细胞的数量(三个区域。P<0.01,所有度拉糖肽治疗组vs.Model组),Model组的星形胶质细胞更大、分枝更多。在度拉糖肽治疗的三个剂量组中,Middle组大鼠海马的星形细胞略高于Low组和High组(CA1和CA3区。P<0.01,Low组和High组vs.Middle组)。western blotting定量结果也证实了这些结论(Iba1的蛋白水平:P<0.01,Model组vs.Sham组;P<0.01,所有度拉糖肽处理组vs.Model组;P<0.01,Low组和High组vs.Model组)。4.在Neu N的免疫荧光定量计数中,与Sham组相比,Model组海马CA1和CA3区的Neu N+细胞数量明显减少(CA1和CA3区:P<0.01)。在CA1区,度拉糖肽治疗组的Neu N+细胞明显多于Model组(CA1区:P<0.01,Low组和High组vs.Model组;P<0.05,Middle组vs.Model组),而在CA3区,度拉糖肽治CHIR-99021临床试验疗组的Neu N+细胞数量仅在High组明显高于Model组(CA3区:P<0.01,High组vs.Model组)。5.我们应用western blot测定了各组大鼠海马中的GAD67含量。与Sham组相比,Model组的GAD67含量明显下降(P<0.01),表明VD大鼠海马中的GABA能神经元减少。这种GABA能神经元的损伤被度拉糖肽治疗所缓解(P<0.05,Low组vs.Model组;P<0.01,Middle、High组vs.Model组)。小结:1.VD大鼠海马CA1及CA3区出现了明显的组织病理学变化,度拉糖肽可以减轻这种病理学变化。2.BCCAO所诱导的VD大鼠模型海马星形胶质细胞及小胶质细胞出现明显增殖,度拉糖肽可以减轻这种现象。3.VD大鼠海马表现出显著的神经元损伤,经过度拉糖肽干预后,海马神经元损伤得到减轻,其中高剂量组效果优于另两个剂量治疗组。4.度拉糖肽缓解了VD大鼠海马GAD67蛋白水平下降的现象。第四部分度拉糖肽对血管性痴呆大鼠海马组织凋亡及自噬的影响目的:第三部分实验中HE和免疫荧光染色均显示VD大鼠海马区的神经元出现了损伤和减少。由于细胞凋亡和自噬是神经元损伤和死亡的两个主要过程,我们检测了与细胞凋亡和自噬相关的各种蛋白的表达变化,以解释为什么度拉糖肽治疗可以减少神经元死亡。方法:应用western blot检测各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、ccaspase-3、LC3B、Beclin 1、p62蛋白的表达。结果:1.Bcl-2/Bax比率和剪切后的caspase-3(cleaved-caspase-3,c-caspase-3)都是细胞凋亡的标志物。与Sham组相比,Model组的Bcl-2/Bax比率明显下降(P<0.01),c-caspase-3表达增加(P<0.01)。此外,与Model组相比,所有三个度拉糖肽处理组都表现出Bcl-2/Bax比率的显著增加(P<0.01,所有度拉糖肽处理组vs.Model组)和c-caspase-3的减少(P<0.05,Low组和High组vs.Model组;P<0.01,Middle组vs.Model组)。此外,在三个度拉糖肽治疗组中,Low组的Bcl-2/Bax比率高于其他两组(P<0.05,Middle组vs.Low组;P<0.01,High组vs.Low组),而Middle组在降低c-caspase-3的蛋白表达方面比其他两组有更好的效果(P<0.01,Low组和High组vs.Middle组)。2.LC3B-II/LC3B-I比率、P62和Beclin-1都是参与调节自噬的指标。LC3B-II/LC3B-I比率在Model组明显高于其他四组(P<0.05,High组vs.Model组;P<0.01,Sham组、Low组和Middle组vs.Model组)。此外,LC3B-II/LC3B-I比率在三个度拉糖肽治疗组中相似。五组之间的Beclin-1没有明显差异。与其他四组相比,Sham组的大鼠显示出P62的表达升高(P<0.01,其他四组vs.Sham组)。度拉糖肽治疗组的P62表达也明显高于Model组(P<0.01,所有度拉糖肽治疗组vs.Model组相比)。小结:1.慢性脑缺血缺氧诱导细胞凋亡及自噬过度激活,致使VD大鼠海马区神经元变性及死亡。2.度拉糖肽的神经保护作用可能是通过减轻神经元凋亡及调节自噬而发挥的。第五部分度拉糖肽对血管性痴呆大鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响目的:探讨PI3K/Akt/m TOR信号通路是否参与度拉糖肽的神经保护作用。方法:应用western blotting检测PI3K、Akt和m TOR蛋白水平及其磷酸化水平,并采用RNA-Sequencing技术检测了High组、Sham组、Model组的基因差异,根据组间差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)进行统计分析,得到DEGs分析、DEGs GO富集分析、DEGs KEGG通路富集分析等结果。结果:1.与其他组相比,度拉糖肽治疗组的p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的蛋白表达水平相对增加,而PI3K、Akt和m TOR在各组之间没有明显差异。p-Akt和p-m TOR在VD大鼠(治疗组和未治疗组)中相对于Sham大鼠均呈上升趋势(p-Akt和p-m TOR:P<0.05,Model组vs.Sham组;P<0.01,所有度拉糖肽治疗组vs.Sham组)。在p-PI3K蛋白的检测中,Model组的p-PI3K蛋白高于Sham组,但差异不明显,而度拉糖肽治疗组与Sham组相比有明显增加(P<0.05,Low组vs.Sham组;P<0.01,Middle组和High组vs.Sham组)。在接受度拉糖肽治疗的三组中,p-PI3K和pAkt在三个剂量组间没有明显差别,而p-m TOR在Middle组相较其他两组有更明显的增加(P<0.05,Low组和High组vs.Middle组)。2.取Sham组、Model组和High组的海马组织提取RNA进行RNASequencinselleckchem Enasidenibg测序。与Sham组相比,Model组有17个上调基因和23个下调基因,而度拉糖肽高剂量治疗组与Model组相比有19个上调基因和78个下调基因。DEGs被分为三个主要的GO组:分子功能,细胞成分,和生物过程。根据结果,High组与Model组的DEGs主要富集在细胞成分和分子功能类基因中。KEGG通路分析显示,Model组与Sham组的DEGs明显富集于神经活性配体-受体相关基因,High组与Model组在包括m TOR信号通路在内的4条通路中明显富集。3.根据差异化的基因统计,与Model组相比,Deptor在High组中明显下调,而High组的Pdpk1与Model组相比存在下调趋势,但经统计学分析后未有明显差异。High组和Sham组核糖体相关的Rpl17相比Model组均出现明显上调(P<0.05,Sham组vs.Model组;P<0.01,High组vs.Model组)。与Model相比,LOC100362149在High组也明显上调(P<0.01,High组vs.Model组)。小结:1.在对VD大鼠的治疗中,度拉糖肽促使PI3K/Akt/m TOR磷酸化增加,这一现象可能与其神经保护作用相关。2.RPL17在度拉糖肽治疗组中升高,提示度拉糖肽应用时可能需要注意与情绪相关问题。