布鲁氏菌病(BrucelEntinostat核磁losis)简称布病,是由布鲁氏菌侵入机体后引起的一种常见的人畜共患传染病,对养殖业发展和人类健康有着重大威胁。布鲁氏菌是革兰氏阴性兼胞内寄生菌,其主要毒力特征为在细胞内进行生存和复制并引发感染。IV型分泌系统(Type IV secretion system,T4SS)作为布鲁氏菌重要的毒力因子,它可将布鲁氏菌效应蛋白(又称效应子)分泌到宿主细胞后作用于重要的信号通路,干扰宿主细胞的先天免疫反应,从而促进布鲁氏菌在宿主细胞内存活与复制并建立持续感染。有研究表明,布鲁氏菌T4SS可分泌至少15种效应蛋food microbiology白,其中效应蛋白Btp B可通过多种方式干扰宿主细胞的天然免疫应答,其中包括干扰TLRs信号转导进而抑制下游免疫级联反应。有研究表明布鲁氏菌效应蛋白Btp B与Btp A均含有TIR结构域,且Btp A可通过完PF-6463922 molecular weight整的TIR结构域来影响靶蛋白的泛素化修饰以此介导炎症反应,而Btp B与泛素化修饰的关系尚不清楚,因此其调节炎症反应的机制也有待进一步研究。基于此,我们猜测Btp B可能通过影响靶蛋白的泛素化修饰来介导机体的炎症反应,因此为了探究Btp B与泛素化修饰关系,首先通过Western blot实验确定了在细胞整体水平上Btp B呈剂量依赖性影响泛素化修饰。接下来为了探索Btp B是否通过影响泛素化修饰后进一步影响炎症反应,首先我们用野生型布鲁氏菌2308(2308WT)和Btp B缺失株(2308Δbtp B)去侵染细胞,通过Western blot检测发现2308WT菌株感染细胞后p65蛋白的磷酸化水平增加,表明布鲁氏菌感染可激活NF-κB信号通路,相较于2308WT菌株的感染,Δbtp B缺失株感染细胞后p65蛋白的磷酸化修饰明显增强,说明Btp B可以抑制NF-κB信号通路的转导。随后向细胞中转染Btp B,通过Western blot检测发现Btp B可以抑制I-κB蛋白的降解进而抑制p65蛋白的磷酸化,从而抑制了NF-κB信号通路。接下来我们通过荧光定量检测在布鲁氏菌感染时细胞内炎症因子的分泌情况,发现与2308WT菌株感染相比,Δbtp B缺失株感染后促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的分泌增加,抗炎因子IL-10的分泌减少,说明Btp B的缺失促进了促炎因子的分泌。随后向细胞中转染Btp B直接观察Btp B对炎症因子分泌的影响,发现Btp B抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的分泌,促进抗炎因子IL-10的分泌,结果说明Btp B可能参与调节宿主的炎症反应。最后我们通过免疫共沉淀实验鉴定出Btp B可以特异性去除TRAF6以及NEMO的泛素化修饰,并进一步表明Btp B可通过特异性去除TRAF6 K63形式连接的泛素化修饰阻碍信号级联反应以此发挥负向调控作用;另外,我们也发现Btp B通过减少STUB1的表达量进一步使NEMO的表达量下调,从而影响NEMO的泛素化修饰。综上所述,布鲁氏菌效应蛋白Btp B通过特异性去除TRAF6 K63形式连接的泛素化修饰,以及通过减少STUB1的表达量进一步下调NEMO的表达量来共同对NF-κB信号通路进行负调控并抑制了促炎因子的分泌,减弱宿主对布鲁氏菌的先天免疫反应,促进布鲁氏菌的胞内生存。本研究从Btp B可能具有影响宿主细胞泛素化修饰的能力为切入点,探索Btp B通过影响靶蛋白泛素化修饰来介导机体炎症反应的机制,为布鲁氏菌通过T4SS分泌效应蛋白调节宿主先天免疫反应以及深入研究布鲁氏菌胞内生存的分子机制提供了新的理论依据。