VX-445分子量霉菌毒素是真菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢产物,霉菌毒素污染严重威胁人类和动物的健康。长期以来,霉菌毒素中毒引起仔猪肠道、肝脏和肾脏等功能器官受损,造成仔猪发育迟缓、腹泻甚至死亡,给我国生猪产业造成巨大经济损失。然而,目前关于霉菌毒素对仔猪肝肠毒性过程中潜在的调控靶点和分子机制研究仍不清楚。近年来,核受体作为调控多种生物过程的重要转录因子,在畜禽疾病的诊疗中受到广泛关注,具有抗性育种靶标研发和应用的潜力。因此,本研究从核受体转录调控角度出发探寻参与霉菌毒素诱导仔猪肝肠损伤的内源性作用途径,并筛选抗霉菌毒素的潜在靶点,进而为提升仔猪对霉菌毒素抗性的研究提供重要科学依据和理论基础。本研究主要研究霉菌毒素暴露仔猪的生长性能和病理损伤途径,结合转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析和靶向通路的功能验证,发现铁死亡可介导霉菌毒素诱导仔猪肝肠损伤;通过胆固醇含量、铁死亡关键生物酶活力检测和染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)测序,分析筛选参与调控铁死亡的关键通路;然后,利用RNA-seq和小分子靶向药功能试验筛选出调控铁死亡的核心核受体;此外,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、双荧光素酶报告基因检测,结合转座酶可及性染色质高通量测序(Assay for transposase accessible chrprotozoan infectionsomatin with high throughput sequencing,ATAC-seq),筛选出核心核受体调控的铁死亡通路特异性靶基因,并探究其对靶基因调控的分子机制;最后,通过添加海藻提取物链甾醇(Desmosterol,DES),从细胞和个体层面探究DES添加对霉菌毒素诱导仔猪肝肠损伤的缓解作用与机制。主要研究结果如下:1.霉菌毒素诱导铁死亡造成仔猪肝肠损伤为了探究仔猪抵抗霉菌毒素的内源性作用途径,本研究对霉菌毒素暴露仔猪的生长性能、血清生化指标以及肝肠病理损伤进行测定,发现霉菌毒素能够显著降低仔猪体重和采食量,并导致肝脏谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate amino transferase,AST)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)含量升高,肝细胞空泡化增多以及肠道绒毛萎缩破损,成功构建了霉菌毒素暴露仔猪肝肠损伤模型;通过小鼠饲喂试验发现,霉菌毒素同样能够降低小鼠体重和采食量,诱导肝脏、肾脏和脾脏脏器指数改变,增加炎性细胞分泌水平,并提高肝脏和肾脏损伤指标ALT、AST、ALP、尿酸(Uric acid,UA)等的含量,加剧肝脏和肠道组织病理损伤;对霉菌毒素暴露的肝肠细胞进行RNA-seq测序及差异基因的GO(Gene Ontology)功能注释和基因富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA),筛选到铁死亡通路在霉菌毒素暴露后被显著富集,其中,铁死亡激活基因表达量显著升高,而铁死亡抗性基因表达量显著降低,铁死亡通路关键基因的qRT-PCR和Western blot检测进一步验证了上述结果;利用铁死亡通路抑制剂对呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)诱导肠道细胞损伤开展挽救试验,发现铁死亡抑制剂干预可缓解DON诱导的细胞损伤;功能试验验证结果表明,铁死亡抑制剂干预可有效减少DON诱导的脂质过氧化物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)蓄积,并恢复还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)含量,抑制氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione,GSSG)含量。由此表明,铁死亡可介导霉菌毒素诱导的仔猪肝肠损伤。2.甲羟戊酸(MVA)途径参与核受体RORγ对铁死亡的调节为了探究参与调控铁死亡的关键途径,对霉菌毒素暴露猪空肠上皮细胞(Intestinal porcine epithelial cell line,IPEC-J2)进行 RNA-seq 分析,发现差异表达基因显著富集在胆固醇代谢通路;通过qRT-PCR和Western blot进一步验证发现,甲羟戊酸途径(Mevalonatepathway,MVA)关键基因和胆固醇通路主调节因子SREBP2在霉菌毒素暴露后表达显著下调;对霉菌毒素诱导的仔猪肝脏中MVA-铁死亡通路关键指标进行检测,结果显示,霉菌毒素Alisertib配制暴露显著减少仔猪肝脏胆固醇和胆汁酸合成,降低MVA代谢产物角鲨烯的含量,并导致调控铁死亡的关键生物酶谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、谷胱甘肽合成酶(Glutathione Synthetase,GSS)和角鲨烯合成酶(Squalene synthase,SQS)酶活性受到显著抑制。前期研究发现,核受体RORγ能够直接调控MVA途径基因并阻断SREBP2介导的胆固醇负反馈。本研究利用ChIP-seq探究霉菌毒素对RORγ与MVA途径基因结合能力的影响,结果显示,霉菌毒素能够降低RORγ与MVA途径基因调控区的结合能力;ChIP-qPCR进一步分析显示,霉菌毒素暴露减少组蛋白H3K27ac、H3K4me1和H3K4me2以及辅助因子P300和SRC-3在MVA途径中HMGCS1基因增强子区域的富集程度。由此表明,MVA途径参与RORγ介导霉菌毒素诱导的仔猪肝脏铁死亡过程。3.RORγ介导霉菌毒素诱导仔猪肝肠细胞铁死亡为了筛选调控仔猪肝肠细胞铁死亡的关键靶点,本研究利用RNA-seq对核受体成员表达进行比较分析,结果发现,霉菌毒素暴露后核受体RORγ和REV-ERBα表达差异最显著;利用靶向RORγ的小分子激活剂(SR0987和DES)以及靶向REV-ERBα的小分子抑制剂(SR8278)对霉菌毒素诱导的猪肠道细胞损伤开展挽救试验,结果显示,DES对霉菌毒素诱导的细胞毒性缓解作用最显著;qRT-PCR和Western blot检测发现不同霉菌毒素暴露均能下调RORγ的表达;在此基础上,本研究利用亚硫酸氢盐测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP)探究影响RORγ表达的表观遗传修饰方式,结果显示,霉菌毒素引起猪肠道细胞中RORγ启动子区DNA甲基化水平升高,并且mC-4位点甲基化与其mRNA表达呈显著负相关关系,ChIP-seq分析进一步发现霉菌毒素诱导仔猪肝脏中RORγ在全基因组的富集程度降低。由此表明,RORγ是霉菌毒素诱导仔猪肝肠细胞铁死亡的关键靶点。4.RORγ调控铁死亡通路基因SLC7A11缓解霉菌毒素诱导的猪肠道细胞损伤为了探究核受体RORγ调控铁死亡通路的潜在作用机制,本研究构建RORγ过表达细胞系,通过台盼蓝染色、透射电镜观察和铁死亡表型鉴定,发现RORγ过表达能缓解霉菌毒素诱导的猪肠道细胞存活率降低,恢复受损的线粒体结构,同时降低细胞中总铁和亚铁水平,减少MDA和ROS蓄积,增加GSH合成;利用qRT-PCR、Westernblot检测和ATAC-seq分析,发现霉菌毒素诱导铁死亡通路关键基因SLC7A11的mRNA和蛋白表达水平下调,启动子染色质开放程度降低;双荧光素酶报告基因检测发现RORγ过表达能增强SLC7A11的启动子活性,然而结合位点突变后导致RORγ对SLC7A11的转录调节能力消失;在RORγ过表达细胞系中转染si-SLC7A11后检测铁死亡表型指标,结果显示,沉默SLC7A11导致霉菌毒素暴露细胞中总铁和亚铁含量升高,MDA和ROS水平增加,GSH含量减少,线粒体超微结构损伤;通过ChIP-qPCR检测,发现霉菌毒素暴露导致辅助因子P300和组蛋白(H3K27ac、H3K4me1和H3K4me2)在SLC7A11启动子区富集减少。由此表明,RORγ通过调控SLC7A11基因缓解霉菌毒素诱导的猪肠道细胞铁死亡。5.链甾醇激活RORγ缓解霉菌毒素的毒性本研究利用乙酸乙酯萃取和HPLC-MS分析,从海藻中成功提取靶向RORγ的小分子激活剂DES;在猪肠道细胞中添加DES,通过RNA-seq筛选差异表达基因并进行功能富集分析,发现胆固醇稳态、氧化磷酸化、活性氧和炎症反应通路被显著富集;利用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和ROS检测,发现DES能引起细胞因子分泌增多和ROS水平降低;通过Calcein/PI荧光染色和Caspase3/7细胞活性检测,发现DES可缓解霉菌毒素诱导的细胞凋亡和细胞活力下降;利用流式细胞术检测发现,DES可缓解霉菌毒素诱导的ROS水平升高和线粒体膜电位降低;进一步通过ELISA分析和抗氧化应激指标检测,结果显示,DES能够减少霉菌毒素诱导的细胞因子分泌,并能恢复抗氧化酶活力;最后,在仔猪日粮中添加DES,并进行腹泻率和肝肠损伤指标测定,发现DES能显著降低霉菌毒素诱导的仔猪腹泻,并能缓解仔猪肝脏损伤和维持肠道屏障完整性。