研究背景和目的:异种器官移植被认为是彻底解决器官短缺问题的潜在手段。敲除几个重要的异种糖抗原能够有效避免超急性排斥反应,而多基因编辑猪的产生以及免疫抑制方案的优化使得猪到NHPs的器官(肾脏)移植的存活时间显著延长。大量研究表明,表达人补体selleck产品调节蛋白可以调节整个移植过程中补体激活,防止广泛的组织损伤,而一些凝血调节蛋白的表达可以抑制移植后human fecal microbiota的血栓形成,延缓器官排斥反应,这两类基因的补充将有利于异种移植物的长期存活。此外,仅敲除供体猪表面糖抗原,结合受体CD4T细胞耗竭的免疫抑制方案也实现了移植物的长期存活,提示适应性免疫应答在异种移植排斥中也发挥着重要作用www.selleck.cn/products/Rapamycin。虽然,猪-NHPs器官移植的最长存活时间一再突破,然而长期存活的成功率较低,这也是异种器官移植临床应用的主要瓶颈。因此,改进供体猪基因编辑策略(降低供体的适应性免疫原性)和优化移植方案可能有助于提高移植效果,实现移植受体的长期稳定存活。猪-NHPs移植模型被认为是验证基因编辑猪的器官移植效果的理想模型,但NHPs实验的高成本和复杂程序阻碍了其大规模应用于对移植供体的筛选和测试。而血管以及p ECs是受者循环血液和移植器官之间的边界,其表面表达猪特异性抗原会引起移植排斥,此外,p ECs的激活或损伤可能导致移植物中的补体和凝血因子沉积,引起凝血相关综合征,进而导致移植器官功能障碍。通过体外实验很难精确地反映复杂的体内异种免疫反应。因此,需要开发小动物模型来研究人对猪动脉血管组织(Pig artery tissues,PAT)及p ECs异种免疫应答。本团队前期构建了低免疫原性的GGTA1-/-β2M-/-CIITA-/-三基因敲除猪(GBC-3KO),通过敲除β2M和CIITA基因阻断猪细胞表面的猪白细胞抗原(Swine leukocyte antigen,SLA)I/II分子的表达,在体外通过混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocytes reaction,MLR)证明,GBC-3KO细胞能显著降低人T细胞免疫应答,皮肤移植实验表明GBC-3KO组织具有较低的免疫原性,可以延缓移植排斥。本研究在GGTA1-/-β2M-/-CIITA-/-三基因敲除的基础上,添加两个补体调节蛋白和两个凝血调节因子,构建GGTA1-/-β2M-/-CIITA-/-h CD55/h CD46/h EPCR/h TFPI基因编辑猪(GBC-4F),并通过植入PAT的人源化小鼠模型和猪-猕猴的生命支持肾脏移植模型来研究GBC-4F组织/器官在异种移植排斥中的免疫反应。方法:1在GBC-3KO细胞的基础上,通过PB转座子系统随机插入两个补体激活抑制基因(h CD46、h CD55)和两个凝血调节基因(h EPCR、h TFPI)。在m RNA及蛋白水平检测基因表达情况,通过与人血清补体共孵育,研究其基因表达效果;2将PAT移植到具有人免疫系统(human immune system,HIS)的人源化小鼠或免疫缺陷小鼠(NSG)肾被膜下,使用组织学和免疫组织化学方法研究移植物存活、人类免疫细胞浸润和抗体沉积情况。使用MLR和抗体介导的补体依赖的细胞毒作用(Complement dependent cytotoxicity,CDC)对供者抗原特异性免疫反应进行定量。随后,将野生型(wild type,WT)或GBC-4F PAT移植到HIS小鼠肾被膜下。并通过上述方法研究两组之间的免疫原性及免疫排斥反应差异;3使用GBC-4F作为供体,猕猴作为受体,进行生命支持的肾脏移植,结合诱导(抗胸腺细胞球蛋白、抗CD20m Ab)、维持(抗CD154 m Ab、霉酚酸酯、他克莫司、眼睛蛇毒因子)的免疫抑制方案,通过生理生化指标观察移植肾脏功能,使用流式细胞术进行抗供体特异性抗体水平分析,并在移植受体安乐死后使用组织学、免疫组化及免疫荧光法分析移植物损伤程度和免疫排斥特征。结果:1成功构建GBC-4F基因编辑猪,且其能够在SPF屏障内健康长期存活;此外,GBC-4F细胞能在体外抵抗人血清中抗体介导的CDC作用。2在NSG小鼠的PAT移植物中,可以检测到猪CD31+ECs并从3到5周数量增加了2倍;与NSG小鼠相比,在HIS小鼠的PAT异种移植中,猪CD31+ECs的数量显著减少。3在HIS小鼠中,PAT异种移植排斥反应与人免疫细胞的密集浸润(CD4+T、CD8+T、CD20+B、CD68+巨噬细胞)和人Ig M和Ig G抗体的沉积有关,以及三级淋巴结构的形成也提示移植物的消失与免疫排斥反应有关。4在PAT移植的HIS小鼠中检测到稳定的供体猪抗原特异性人T细胞和抗体反应。5在不应用免疫抑制剂的HIS小鼠中,WT PAT移植物在移植后3周,可见大量免疫细胞弥散浸润,但几乎无CD31+ECs,而GBC-4F PAT移植物在移植后3周,仍可见大量CD31+ECs;且WT移植物在移植后5周消失,而GBC-4F移植物仍有许多供体猪细胞存在;在WT PAT中形成了三级淋巴结样结构,而GBC-4F PAT中未见此结构。6相比于WT移植物,GBC-4F PAT移植后的HIS小鼠,产生较低的抗供体T细胞及抗体应答。7两例GBC-4F-猕猴的生命支持肾脏移植分别存活了51天和70天;使用GBC-4F作为异种移植供体,结合常规免疫抑制方案,可以很好的控制体液免疫反应,不会引起受体中的抗供体的特异性抗体升高。8持续使用CVF可以较好的控制受体猴体内的C3水平;猪-猕猴异种肾移植后出现的肾盂积水加速移植物功能丧失,导致移植失败。结论:本文成功构建了低T细胞反应性、表达补体调节蛋白和凝血调节因子的7基因编辑猪(GBC-4F);利用首次构建的PAT HIS模型(HIS小鼠可体内排斥PAT,产生抗供体特异性T细胞及B细胞应答)表明,在无免疫抑制条件下,相比于WT PAT,GBC-4F PAT能够延迟T细胞依赖的移植排斥反应;在GBC-4F-猕猴的肾脏移植中,结合适当的免疫抑制方案,可以很好的控制体液免疫反应,而异种移植后发生的肾盂积水不利于移植肾的长期存活。