血管性认知障碍(Vascular cognitive impairment,VCI)和血管性痴呆(Vascualr dementia,VaD)是指由脑血管疾病的危险因素、显性或非显性脑血管疾病引起的从轻度认知损害到痴呆的一组综合征。在我国人口老龄化进程加速的趋势下,VCI的患病率、发病率和死亡率日益升高,成为当今医疗事业关注的重点之一。VaD是指由脑血管病变引起的或与脑血管病变相关的一种慢性获得性退行性智力损害综合征,,临床表现为智能障碍,包括认知能力、记忆力、判断和思维能力、计算能力和社会生EPZ-6438试剂活能力的减退,伴随着情感、性格的改变。高血压不仅是我国脑卒中发生的首要原因也是VaD、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等认知障碍独立的危险因素。蛋白质组学是以蛋白质为研究对象,通过质谱技术对生物样本中的蛋白质进行检测和分析,通过对VaD模型动物的蛋白质表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等的研究。而代谢组学技术,是指某一生物或细胞在一特定生理时期内的所有低分子量代谢产物的分析,研究疾病导致机体病理生理过程变化,最终引起代谢产物发生相应的改变关键物质。课题组在前期研究基础上应用防治VaD的中药复方——参麻益智方(SMYZG),获国家新药发明专利(ZL201610565191.5),并批准为北京市医疗机构中药制剂(Z20200005000),由人参、天麻、鬼箭羽、川芎组成,有益气化瘀、平肝潜阳之用。主治气虚血瘀、肝阳上扰证,治疗症见健忘、神情呆滞、智能减退等的VaD。前期动物实验和临床研究表明SMYZG具有改善VCI大鼠的药理作用及多种作用机制,同时能较好改善患者的认知行为和神经功能。课题组拟通过蛋白组学和代谢组学技术分析高血压结合内皮损伤致VaD模型动物的蛋白质表达和代谢产物差异,并进行中药复方SMYZG的干预研究,获得VaD在蛋白质水平上有关疾病发生、细胞代谢等过程的整体且全面的认识。通过分析VaD模型和SMYZG干预后的脑组织代谢产物,寻找VaD的生物标记物,通过标准化和精细化的蛋白质组学、代谢组学及联合组学技术来立体阐释中医药整体观。研究目的:建立自发性高血压大鼠(Spotaneously hypertensive rats,SHR)复合内皮损伤致VaD模型,观察SMYZG对VaD模型大鼠学习记忆能力、海马突触可塑性、血清胆碱能和β-淀粉样蛋白chemical pathology含量的影响。应用蛋白质组学和代谢组学技术,寻找SMYZG干预VaD参与的代谢通路和具有相同变化趋势的差异蛋白、差异代谢物,系统描述SMYZG在生物体内的分子调控机制。研究方法:实验一参麻益智方对SHR结合内皮损伤致认知功能障碍模型的学习记忆和突触可塑性的影响实验动物使用SHR,无特定病原体级别(SPF),雄性,13～14周龄。通过微电流刺激SHR双侧颈动脉形成血栓的方法制备VaD模型,随机分成:VaD模型(ModeL)组、盐酸多奈哌齐组(DNPQ)、SMYZG高剂量组(SMYZG-H)、SMYZG低剂量组(SMYZG-L),每组10只,并给予相应的药物等体积灌胃。选用相同遗传背景的正常血压Wistar-Kyoto大鼠(WKY)作为对照,与ModeL予等体积蒸馏水灌胃,连续8周。采用Morris水迷宫、脑组织病理HE染色、尼氏染色、高尔基银染方法观察SMYZG对大鼠学习记忆功能、海马(CA1、CA3区)病理形态和突触可塑性形态的影响。血清标记物检测采用ELISA法检测炎症因子:白介素(Interleukin,IL)-1 β、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α水平;血管活性物质:血管紧张素(Angiotensin,Ang)Ⅱ、内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)水平;痴呆相关病理产物:β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)含量。采用比色法和化学荧光法检测氧化相关指标,诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nos,iNOS)和活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平。采用比色法检测胆碱能相关指标,乙酰胆碱(Acetyl-choline,Ach)、乙酰胆碱酯酶(Acetyl-cholinesterase,AchE)水平。实验二参麻益智方对SHR结合内皮损伤致认知障碍模型的蛋白组学研究采用液质联用iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究的方法,通过TMTpro 16标试剂标记SMYZG干预模型大鼠基因组表达的全部蛋白质,利用标记报告的离子丰度对蛋白进行精确鉴定和定量。数据分析采用Proteome Discoverer软件的搜索引擎Sequest HT检索Uniport蛋白组数据库,获取蛋白质序列信息。开展SMYZG对血管性认知障碍的蛋白质组学研究,以寻找差异蛋白和药物靶标。实验三参麻益智方对SHR结合内皮损伤致认知障碍模型的代谢组学研究应用TM1000靶向代谢组学技术方法,从代谢物层面分析SMYZG干预模型大鼠脑组织代谢物变化及其作用机制。实验四参麻益智方对SHR结合内皮损伤致认知障碍模型的联PD0325901体内合组学研究将蛋白组学与代谢组学数据通过R4.0.1和cytoscape3.8.2进行生物信息学分析、代谢物与蛋白酶对应、代谢-蛋白联合分析KEGG代谢通路富集、共有KEGG分析、网络分析(Network)等。研究结果:1.SMYZG对VaD模型大鼠记忆学习能力的影响与WKY组比较,Model穿台次数显著减少(P<0.05),目标象限寻找时间减少(P<0.05),目标象限总路程减少(P<0.05);与Model比较,SMYZG-L、SMYZG-H组穿台次数显著增加(P<0.05,P<0.05),目标象限寻找时间增加(P<0.05,P<0.05),目标象限总路程显著增加(P<0.05,P<0.05)。2.SMYZG对VaD模型大鼠海马CA1-CA3区域突触可塑性的影响与WKY组比较,Model组大鼠海马CA1-CA3区HE染色可见细胞排列无规则,细胞核变形固缩,染色加深;尼氏染色可见尼氏体粉末状改变,数量减少,细胞水肿和溶解;高尔基银染可见树突长度变短,树突棘密度降低,可见不成熟神经元;和Model组比较,DNPQ、SMYZG-H、SMYZG-L组海马病理形态有不同程度的改善,尤其SMYZG-H组神经细胞突触密度显著增加。3.SMYXG对于VaD模型大鼠血清学标志物的影响与 WKY 组相比,Model 组 IL-1 β、IL-6、INOS、ROS、TNF-α 含量均显著升高(P<0.05,P<0.05),Ang Ⅱ、ET-1、Aβ、AchE含量均显著升高(P<0.05,P<0.05),CGRP、Ach 含量下降(P<0.05);与 Model 组比较,SMYZG-L 组、SMYZG-H 组:IL-1 β、IL-6、iNOS、ROS、TNF-α 含量均降低(P<0.05,P<0.05),AngⅡ、ET-1、Aβ 含量降低(P<0.05,P<0.05),CGRP、Ach、AchE 含量上升(P<0.05)。4.SMYZG对VaD模型大鼠蛋白质组学的影响筛选SMYZG改善VaD的潜在信号通路与生物标志物,其潜在作用靶蛋白为:表皮生长因子受体(Egfr)、关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rock1)、原癌基因Pik3ca、RAS相关病毒(Rras)、Ⅲ型β微管蛋白3(Tubb3)、细胞色素C氧化酶亚型5A(Cox5a)、非转移性细胞1基因(Nme1),具有改善血管内皮功能、保护神经元、改善认知功能。神经退行性疾病、阿尔茨海默病的关键通路为:AMPK/PGC-1 α/UCP2/ATP5A、HIF/VEGF、VEGF/Flk-1/p8 MAPK,具有血管内皮保护、神经元保护功能。5.SMYZG对VaD模型大鼠代谢组学的影响研究发现SMYZG可影响VaD模型大鼠认知功能作用的差异代谢物质谱,结果显示在代谢物层面的显著标志物为:酪氨酸(Tyr),麦角硫因(ET),鲱精胺(AGM),甲基烟酰胺(MNA),维生素B6(VB6)以及“精氨酸和脯氨酸代谢”、“辅助因子的生物合成”、“氨基酸的生物合成”作用通路。SMYZG与DNPQ在治疗VaD的代谢层面主要差异标记物为:胞嘧啶(Cytosine),一氧化氮合酶抑制剂(L-NMMA),硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate)以及“神经活性配体与受体”、“辅助因子的生物合成”。6.SMYZG对VaD模型大鼠的联合组学研究研究发现VaD发病与SMYZG起效的共同信号是通路神经退行性疾病-多疾病通路、缝隙链接(Gap junction)、ErbB 信号通路(ErbB signaling pathway)。研究结论:SMYZG可以改善高血压合并血管内皮损伤所致血管性痴呆大鼠的学习记忆功能;蛋白组学和代谢组学研究显示涉及“Egfr,Rock1,Pik3ca,Rras,Tubb3,Cox5a,Nme1”差异蛋白与“Tyr,ET,AGM,MNA,VB6”差异代谢物是 SMYZG改善血管性痴呆的潜在生物标志物。从整体性、时空性和复杂性的分子角度阐释VaD模型的高血压和内皮损伤特征,为探索中药复方防治VaD相关机制提供了新视角。