研究背景:传统的疫苗主要由减毒或灭活的微生物及其毒素等代谢产物组成,这些疫苗虽然可诱导有效和持久的适应性免疫反应,但仍存在生产困难、潜在安全隐患等问题。疫苗抗原刺激机体产生特异性应答的本质是其表位特异性应答的集合,其中只有部分表位的免疫应答能够发挥保护作用,这部分表位称作保护性表位。表位疫苗则是由一种或几种保护性表位组成,精准、高效诱导特异性免疫保护应答。与传统疫苗相比,表位疫苗具有安全性更高、效力更强、设计灵活、改造方便等优势。然而,如何鉴定保护性表位并将其高效递送是目前研制表位疫苗需要解决的两大关键瓶颈问题。疫苗(抗原)的结构是其诱导免疫应答的决定性因素,因此基于结构进行表位筛选和优化表位递送是解决上述问题的有效策略。因此,本研究开展了以下两部分的工作:第一部分:以结构为基础动态筛选的铜绿假单胞菌保护性表位及其纳米颗粒表位疫苗的研究研究目的及意义:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院获得性感染特别是下呼吸道感染、烧伤及战创伤感染严重病原菌之一。抗生素是治疗PA感染的主要手段,但效果越来越有限,而且可能出现“抗生素耐药-新抗生素-新抗生素耐药”的死循环,导致无药可用。PA疫苗不仅可以预防感染性疾病的发生,而且还可减少抗生素的使用,在一定程度上缓解甚至解决PA耐药的问题,然而目前为止还没有成功上市的PA疫苗。综合分析发现,现阶段PA疫苗失败的主要原因是未获得高效的保护性抗原组分。传统的PA疫苗抗原成分主要是细菌的鞭毛蛋白、分泌性毒素、细菌III型分泌系统组件蛋白。虽然这些疫苗抗原可以激发机体产生强烈的免疫应答,但是细菌感染机体后这些关键靶标表达量可能下降甚至缺失,从而逃逸宿主的免疫杀伤,最终导致疫苗的保护效果大打折扣。为了解决上述问题,本研究聚焦PA感染过程中细菌恒定和升高表达的蛋白,从中动态筛选出高效的保护性抗原组分,从而研制PA疫苗。外膜蛋白是细菌疫苗抗原的主要靶标,这是因为针对这些抗原的抗体不仅可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),而且还可以通过抑制膜蛋白功能阻断病原体的致病过程。本研究基于感染前后细菌全基因组表达谱,筛选感染过程中表达上调的外膜蛋白作为候选抗原。为了克服外膜蛋白水溶性低等问题,我们以蛋白质结构为基础,聚焦于外膜蛋白胞外的柔性结构域(Loop区),从中筛选免疫优势表位,以此构建表位疫苗。此外,为了克服单一表位肽分子量较小,免疫原性较差,缺少稳定而立体构象,易被降解的问题,在本研究中,我们构建巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米载体,以期增加与之融合的表位肽分子量,增强免疫原性,从而更好地发挥疫苗的免疫保护作用。研究方法:1.定量分析PA感染过程中基因表达谱动态变化情况,筛选表达上调的外膜蛋白,利用生物信息学软件PRED-TMBB预测筛选出的外膜蛋白胞外柔性结构域(Loop区),随后通过液相芯片系统(Luminex)筛选与鉴定强反应性表位,最后将筛选出的强反应性表位肽偶联KLH,与铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA测定血清抗体效价,评价多肽的免疫原性,筛选出最优表位进行后续实验。2.基于DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)与细胞膜的相互作用,将连接了DSPE-PEG2000的多肽偶联至巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒载体(PNPs@M)上,制备偶联表位肽PA4554 C167-W193的巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193),并通过SDS-PAGE、透射电镜及动态光散射实验对其纳米表征进行检测,通过细胞毒性实验、溶血实验及体内毒性实验对该疫苗的安全性进行评价。3.分别于第0天、第14天和第21天使用纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)肌肉注射免疫小鼠,并分别设置巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒载体(PNPs@M)、游离表位肽(Ep_(167-193))及空白组(PBS)作为对照。ELISA测定接种疫苗后小鼠血清中抗Ep_(167-193)总Ig G抗体水平及其亚型水平;末次免疫后7天,小鼠进行PA XN-1攻毒感染,通过测定攻毒后小鼠感染体征评分、体重变化情况、小鼠肺组织细菌定植情况、小鼠肺组织匀浆上清中炎性细胞因子水平及观察肺组织HE染色切片,评价纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)在小鼠急性肺炎模型中的保护效果。研究结果:1.从PA感染前后表达水平稳定或升高的8个外膜蛋白中预测得到54条胞外Loop,利用Luminex系统从中筛选出8个免疫反应性较强的表位肽,分别为PA4554 C167-W193,PA2398 F636-G672,PA0165 R163-A174,PA2398 K694-Q712,PA0958 A200-Q235,PA2398 T302-V331,PA4554 D148-T172。我们选择本研究首次发现且免疫原性较好的表位PA4554 C167-W193进行后续研究。2.成功制备偶联表位肽PA4554 C167-W193的巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193),其平均粒径为272.2±4.0 nm,Zeta电位为-18.2±0.5 m V,PDI值为0.281±0.007,分散性良好;透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)结果显示,纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)呈球状,表面光滑,无明显聚集;该疫苗安全性良好,未观察到显著的细胞毒性、溶血效应及体内毒性。3.纳米PF-6463922纯度颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)免疫小鼠后,血清中特异性抗Ep_(167-193)总Ig G抗体水平显著高于PNPs@M组、Ep_(167-193)组及PBS组,且以Ig G1亚型为主;攻毒感染后,与其余三组相比,PNPs@M-Ep_(167-193)组小鼠大体感染症状较轻、肺组织细菌定植量及肺匀浆上清炎性细胞因子水平较低、肺组织结构完整且无明显病理改变。研究结论:1.表位PA4554 C167-W193是PA感染前后表达水平上调的外膜蛋白功能区免疫优势表位。2.成功制备偶联表位肽PA4554 C167-W193的巨噬细胞膜包裹的PLGA纳米颗粒表位疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)。3.纳米颗粒疫苗PNPs@M-Ep_(167-193)具有良好的安全性,可诱导针对Ep_(167-193)的Th2型免疫应答,在小鼠急性肺炎模型中发挥明显的保护效果,是一个良好的候选PA疫苗。第二部分:基于抗体恒定区移植表位的自组装纳米颗粒肿瘤疫苗的构建及其保护机制研究研究目的及意义:恶性肿瘤已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一,对国民的健康和经济发展造成了严重的威胁。以抗体和疫苗为核心的免疫疗法已逐渐成为治疗肿瘤的强力手段,特别是以肿瘤新抗原为核心的个性化疫苗取得了长足的进步,具有成本低、安全性好的优点。然而针对肿瘤新抗原的个性化疫苗还存在稳定性差、免疫原性弱等瓶颈问题,限制了其临床疗效和推广应用。以纳米颗粒为载体的疫苗递送系统为解决上述问题提供了强有力的手段:将抗原表位包裹在纳米颗粒中或通过适当修饰后负载在纳米颗粒表面,从而使其组装形成纳米颗粒疫苗。纳米颗粒疫苗具有许多优势,主要有纳米颗粒可保护其负载的抗原不被蛋白酶等降解并增强抗原递呈细胞的摄取;它还可以形成仓库效应,从而增加抗原在注射部位的保留时间,增加疫苗暴露于免疫细胞的时间;此外,纳米颗粒疫苗可以模仿病原体的大多数特征,例如大小、形状以及病原体相关分子模式等;通过对纳米颗粒进行改造或修饰,可以使其靶向特定的器官或细胞plant synthetic biology。在前期研究PA表位疫苗的过程中,本研究应用纳米颗粒制备技术显著提升了表位疫苗的免疫应答水平,因此,我们又尝试将该技术用于提升肿瘤新抗原个性化疫苗的免疫疗效,以期为免疫原性PD-0332991细胞培养弱的新生抗原疫苗提供新的解决思路与手段。在本部分研究中,我们基于抗体恒定区结构域(Fc)的结构,选择模式抗原卵清蛋白CD8~+T细胞表位肽(OVA_(257-264))作为免疫原,根据重组蛋白表达量筛选到Fc结构中OVA_(257-264)表位的最适移植位点,制备携带表位肽OVA_(257-264)的Fc融合蛋白Fc-OVA_(257-264);构建铁蛋白(Ferritin)与四串联重复金黄色葡萄球菌A蛋白B结构域(Sp A4B)的融合蛋白FNP(Ferritin-based nanoparticle),通过Sp A4B与Fc的高亲和性,构建新型递送OVA_(257-264)表位的铁蛋白纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264),以期提高抗原OVA_(257-264)的免疫原性和保护效果,为肿瘤新抗原疫苗的成功研发打下基础。研究方法:1.基于抗体恒定区结构域(Fc)的结构,从5个Fc的柔性区(Loop)中筛选OVA_(257-264)表位最适移植位点;利用大肠杆菌和293F细胞分别表达FNP蛋白与Fc-OVA_(257-264)蛋白;制备复合物FNP-Fc-OVA_(257-264),并通过分子筛层析、动态光散射及透射电镜对上述蛋白及复合物的纳米表征进行检测;通过细胞毒性实验、溶血实验及体内毒性实验对纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)的安全性进行评价。2.通过ELISpot实验筛选与FNP-Fc-OVA_(257-264)配伍的最适佐剂,分别于第0天、第14天和第28天皮下免疫C57BL/6小鼠,末次免疫后14天,ELISpot及四聚体染色实验检测小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌情况及OVA_(257-264)特异性CD8~+T细胞水平;末次免疫后4个月,ELISpot检测小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌情况,评价疫苗长期免疫应答。3.利用小鼠皮下E.G7-OVA细胞荷瘤模型评价纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)的预防和治疗效果,通过肿瘤体积、小鼠生存率及核磁共振成像等指标进行评估;免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色检测肿瘤组织中CD8~+T细胞浸润。4.通过激光共聚焦及流式细胞术检测DC2.4细胞体外摄取抗原水平,通过流式细胞术检测纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)促进小鼠BMDC细胞成熟能力,利用CFSE标记法检测疫苗诱导OT-1小鼠CD8~+T淋巴细胞体外增殖水平;纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫小鼠后,通过流式细胞术检测小鼠腹股沟淋巴结DC细胞成熟及交叉递呈抗原能力。研究结果:1.从Fc的柔性区(Loop)结构域中筛选出了最佳外源表位插入位点;成功制备了纯度较高、可溶表达的FNP蛋白及Fc-OVA_(257-264)蛋白;二者按照摩尔比1:12物理混合后,可形成粒径较为均一,且分散性良好的纳米颗粒表位疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264),其平均粒径值为182.4±12.9 nm,PDI值为0.252±0.035,与载体FNP的粒径值(35.8±1.5 nm,PDI=0.261±0.004)相比显著增大;该疫苗安全性良好,未观察到显著的细胞毒性、溶血效应及体内毒性。2.筛选出与FNP-Fc-OVA_(257-264)配伍的最适佐剂Poly I:C,末次免疫后14天,纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫组小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平及OVA_(257-264)特异性CD8~+T细胞水平显著高于Fc-OVA_(257-264)组及PBS组;末次免疫后4个月,FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫组小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平显著高于Fc-OVA_(257-264)组及PBS组,但较末次免疫后14天应答水平有所下降。3.在预防效果评价模型中,FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫组小鼠肿瘤体积显著小于Fc-OVA_(257-264)组及PBS组,观察期内生存率达到70%,显著高于其余两组,且FNP-Fc-OVA_(257-264)组小鼠肿瘤组织中可以观察到大量的CD8~+T细胞浸润;在治疗效果评价模型中,FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫组小鼠肿瘤体积也显著小于Fc-OVA_(257-264)组及PBS组,观察期内生存率达到30%,显著高于其余两组,且FNP-Fc-OVA_(257-264)组小鼠肿瘤组织中可以观察到大量的CD8~+T细胞浸润。4.与Fc-OVA_(257-264)组及PBS组相比,FNP-Fc-OVA_(257-264)处理组DC2.4细胞摄取抗原效率、小鼠BMDC细胞成熟能力、OT-1小鼠CD8~+T淋巴细胞体外增殖水平显著增强;纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)免疫组小鼠腹股沟淋巴结DC细胞成熟能力及交叉递呈抗原能力显著高于Fc-OVA_(257-264)组及PBS组。研究结论:1.成功制备基于抗体恒定区移植表位的自组装纳米颗粒肿瘤疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264),该疫苗具有良好的安全性。2.纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)可以显著增强抗原特异性CD8~+T细胞应答,且在预防性和治疗性肿瘤模型中发挥显著的保护作用。3.纳米颗粒疫苗FNP-Fc-OVA_(257-264)可以促进DC细胞的成熟及对抗原的摄取和交叉递呈。