斑蝥素(CTD)为有毒中药斑蝥的主要有效成分,对肝细胞癌(HCC)、肺癌和乳腺癌疗效独特,但安全范围狭窄,易对胃肠道和泌尿系统产生强烈的刺激和腐蚀作用,使其临床应用受限。目前解决该问题的方式有两种。第一种是通过结构修饰合成CTD衍生物,这种方式虽然能降低毒性,但也会导致药物抗肿瘤活性的降低。第二种是将CTD包载于药物载体中,这种方式能在减毒的同时保留原有的药物活性,因而受到广泛关注。脂质体具有免疫原性和高载药能力,是一种生物相容性良好的药物载体。普通脂质体通常利用胆固醇稳定磷脂双层的结构,但其也存在一定的不足,如胆固醇的氧化产物易引起致突变性和潜在致癌性、胆固醇的富集易引发“补体介导的假性过敏反应”等。利用immunoelectron microscopy天然活性物质如甾醇和皂苷等替代胆固醇设计的新型给药系统可避免胆固醇引发的问题且具有独特的优势,如人参皂苷Rg3替代胆固醇制备的新型脂质体能增加脂质体的稳定性和靶向能力,通过调节肿瘤微环境、协同杀伤癌细胞等途径增强化疗药物的疗效。甘草酸(GA)具有抗炎、抗肿瘤和保肝等功效,近年有研究发现其还能增加磷脂双层的稳定性。经特异性配体GA修饰的药物载体可将药物主动靶向递送至肝癌细胞,降低其对正常组织的毒副作用。基于GA优异的理化性质和生物活性,以GA替代胆固醇开发一种新型靶向甘草酸脂质体(GA-LP)系统用于CTD的递送(CTD-GA-LP),既能有效克服普通脂质体中胆固醇面临的局限性,又能实购买CP-690550现增强CTD抗肿瘤效果并降低其毒副作用的目的。CTD-GA-LP的制备及工艺优化。以粒径、PDI、Zeta电位、包封率和载药量为评价指标,通过方法筛选、单因素考察和Box-Behnken效应面法确定工艺处方:制备方法为乙醇注入法、磷脂(EYPC)与GA质量比为20:7、EYPC与CTD质量比为10:1、乙醇浓度为90%、有机相体积为10 m L、水相体积为10 m L、超声时间为10 min、超声功率为240W。CTD-GA-LP的质量评价。采用激光粒度仪测定脂质体的粒径、PDI和Zeta电位,超滤离心-HPLC法和冷冻干燥法测定包封率和载药量。利用透射电镜(TEM)观察脂质体的形貌,溶血试验和透析法考察安全性和释药行为。结果显示CTD-GA-LP的粒径为(76.12±4.01)nm、PDI为0.18±0.02、电位为(-27.47±1.45)m V,包封率和载药量分别为(90.81±3.32)%和(6.24±0.21)%。TEM显示脂质体均为球形或类球形结构且表面光滑。在贮存15 d内,载CTD的胆固醇脂质体(CTD-C-LP)有絮凝和沉淀现象,粒径和PDI增大且药物泄露严重,而CTD-GA-LP粒径和PDI变化以及药物泄露可忽略不计,且与牛血清白蛋白、0.9%Na Cl和200 U/m L肝素钠共孵育后粒径分布无变化。CTD-GA-LP无溶血现象,在0.2～2 mg/m L的范围内溶血率小于5%,生物相容性良好。CTD-GA-LP在p H 7.4介质中呈现持续缓慢的释放行为,在p H 5.4介质中可加速CTD的释放速率,24 h释放较为完全,而CTD-C-LP在不同p H介质中药物释放无差异。CTD-GA-LP的体内外抗肝癌作用。通过MTT试验评价CTD-GA-LP对L-02和Hep G2细胞活性的影响,DAPI和AO/EB染色法观察Hep G2细胞凋亡情况,同时建立小鼠肝癌H22皮下移植肿瘤模型评价CTD-GA-LP的体内抑瘤效果。体外结果显示,作用于L-02细胞48 h后,CTD对细胞生长产生明显的抑制,而CTD-C-LP和CTD-GA-LP均能INCB018424价格显著降低其细胞毒性。与CTD和CTD-C-LP相比,CTD-GA-LP的细胞存活率明显增加,IC_(50)值为(5.94±0.57)μg/m L,分别增加3.71倍和1.73倍。作用于Hep G2细胞48 h后,CTD-GA-LP呈现最强的抑制效果,IC_(50)值为(2.37±0.27)μg/m L,相比于CTD和CTD-C-LP分别降低2.40倍和1.69倍。与等剂量的CTD和CTD-C-LP相比,CTD-GA-LP的促肿瘤细胞凋亡作用更明显。体内结果显示,CTD-GA-LP对癌细胞呈现较强的杀伤能力,肿瘤抑制率高达74.49%,分别是等剂量CTD和CTD-C-LP的2.12倍和1.33倍,肿瘤坏死区域相比于CTD和CTD-C-LP明显增大,还能显著改善荷瘤小鼠的生存状态,促使其脏器系数趋于正常水平并延长其存活时间。GA-LP的体内外肝癌靶向性研究。采用香豆素6(C6)或DIR作为模拟药物替代无荧光CTD制备载荧光染料的脂质体。利用荧光显微镜和荧光酶标仪评价L-02、Hep G2和H22细胞对C6、载C6的C-LP和GA-LP的摄取情况。采用小动物活体成像观察DIR、载DIR的C-LP和GA-LP在荷瘤小鼠体内的实时荧光分布以及在不同组织中的分布。体外结果显示,孵育2 h后,GA-LP在Hep G2和H22细胞中的荧光强度约为C-LP的1.74倍和2.24倍,可明显增加癌细胞摄取。大量的游离GA预处理后,细胞摄取GA-LP受到抑制,而对C-LP的摄取无影响,表明GA-LP是通过GA受体介导的内吞途径转运入胞。游离GA对Hep G2和H22细胞摄取GA-LP的抑制较强,而对L-02细胞的抑制相对较弱,表明肝癌细胞表面GA受体高表达。体内结果显示,GA-LP在肝脏和肿瘤组织中的荧光分别为C-LP的1.71倍和3.53倍,GA-LP能促进DIR在肿瘤组织中的积累,还有助于延长其在体内的滞留时间。本课题以GA替代普通脂质体中的胆固醇制备一种新颖的GA-LP递送系统,既能增加脂质体的稳定性,又能通过GA受体介导的主动靶向作用提高肝肿瘤靶向效率。与CTD-C-LP相比,CTD-GA-LP能够更有效地将CTD靶向递送至肿瘤细胞,最大限度地增强CTD的体外肿瘤细胞毒性和体内抑瘤效果,并显著减轻其对正常细胞和组织的毒副作用。