发菜(Nostoc flagelliforme)为念珠藻科(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc)陆生固氮蓝藻,分布于我国干旱半干旱荒漠草原地区,具有重要的生态、食用及药用价值。由于其生长环境经常遭受周期性复水和脱水变化selleckchem LY294002,发菜进化出独特的耐旱机制,对干旱具有极强的耐受性。蛋白质丙二酰化修饰是一种普遍存在且高度保守的蛋白质翻译后修饰,在光合作用、碳代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等途径中调控蛋白质功能,进而影响植物生理代谢活动。代谢物是细胞调控的最终产物,可反映植物在逆境胁迫下的代谢应答变化。为了探究发菜响应干旱胁迫的耐旱分子机制,本研究以充分吸水发菜为对照(MA),以失水30%(MB)、失水75%(MC)、失水100%(MD)的发菜为干旱胁迫处理组,利用蛋白质组学方法首次对干旱胁迫发菜进行蛋白质丙二酰化修饰研究,通过对鉴定到的丙二酰化修饰蛋白进行亚细胞定位、差异丙二酰化蛋白功能富集、代谢途径及丙二酰化修饰功能验证,结合丙二酰化蛋白代谢途径中相关酶活性及代谢产物含量测定结果,解析丙二酰化修饰特征及对干旱胁迫的响应机制。同时,利用代谢组学技术对不同干旱胁迫下发菜的代谢谱进行鉴定,分析代谢物种类及其含量变化,构建数据分析模型获得差异代谢物,并进行相关性分析、聚类分析、功能富集分析及代谢通路分析,揭示发菜响应干旱胁迫的代谢调控机制。此外,对干旱胁迫下发菜脂质谱进行鉴定,筛选耐旱生物标志物,分析不同类型脂质的丰度变化对膜脂组成的影响,解析脂质代谢与发菜响应干旱胁迫的关系。本研究在蛋白质丙二酰化修饰水平与代谢水平上揭示发菜响应干旱胁迫的机制,研究结果不仅为全面解析发菜耐旱机制奠定理论基础,而且丰富了低等植物耐旱性研究,并对干旱、半干旱地区特色植物资源保护与开发利用也具有积极的促进作用。本研究主要结果如下:1.发菜响应干旱胁迫的蛋白质丙二酰化修饰研究本研究共鉴定到236个丙二酰化修饰蛋白,421个丙二酰化赖氨酸修饰位点。大部分丙二酰化修饰蛋白(38%)分布在细胞质,14%分布于质膜。GO和KEGG富集分析表明,丙二酰化修饰蛋白在碳代谢和光合作用等代谢途径中高度富集。发菜中有88个差异丙二酰化修饰蛋白在其它物种中具有直向同源物,占所有差异丙二酰化修饰蛋白的72.95%。干旱胁迫下发菜丙二酰化修饰水平降低可能抑制光能的接收和传递,减少卡尔文循环中CO2的固定,从而降低光合作用。丙二酰化修饰可能通过抑制TCA循环碳通量并激活糖异生途径响应干旱胁迫。发菜丙二酰化抗氧化酶参与干旱胁迫早期抗氧化防御。丙二酰化修饰蛋白参与脂质降解和氨基酸生物合成以响应干旱胁迫。根据多序列比对发现,果糖二磷酸醛缩酶(FBA,EC 4.1.2.13)的K306修饰位点、异柠檬酸脱氢酶(IDH,EC 1.1.1.42)的K237位点以及核苷二磷酸激酶(NDK,EC2.7.4.6)的K86位点在蓝藻中高度保守。通过定点突变产生不含丙二酰化修饰基团的突变体,发现丙二酰化修饰具有影响FBA、IDH和NDK活性的作用。2.发菜响应干旱胁迫的代谢组研究利用非靶向代谢组学技术对不同程度干旱胁迫下发菜代谢物动态变化进行分析。共获得92个差异代谢物,大部分属于糖类、氨基酸、核苷酸及其衍生物以及脂类物质。与对照组相比,在发菜失水30%时共鉴定到45个差异代谢物,其中上调35个,下调10个;在失水75%时共鉴定到58个差异代谢物,其中上调46个,下调12个;在失水100%时共鉴定到69个差异代谢物,其中上调25个,下调44个。发菜差异代谢物相关性及聚类分析表明,糖类物质含量与氨基酸类代谢物含量变化趋势一致,二者与脂类物质含量变化趋势相反,在干旱过程中发菜通过代谢物的合成与分解使得代谢物含量发生显著差异以响应干旱胁迫。差异代谢物KEGG富集分析筛选出18条受干旱胁迫影响明显的代谢途径,包括半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸生物合成及嘧啶代谢和嘌呤代谢等。通过对差异代谢物表达模式进行分析,建立了基于代谢物变化的发菜响应干旱胁迫的代谢调控网络,干旱胁迫主要改变了发菜的糖代谢、氨基酸代谢以及脂质代谢,通过底物再分配合成更有利于抗旱的代谢物响应干旱胁迫。对干旱胁迫下参与发菜糖代谢和氨基酸代谢途径中的13个基因进行qRT-PCR分析发现,基因在转录水平的变化与代谢物之间并没有明确相关关系。3.发菜响应干旱胁迫的脂质组研究利用非靶向脂质组学技术对不同程度干旱胁迫下发菜脂质分子进行鉴定与分析,共鉴定到853脂质分子,属于37个亚类,6个主要脂质类别。发菜中主要脂质亚类包括甘油三酯(TG)168种、双半乳糖二酰甘油(DGDG)100种、神经酰胺(Cer)93种,此外,甘油二酯(DG)、单半乳糖二酰甘油(MGDG)、硫代异鼠李糖二酰甘油(SQDG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)及谷甾醇酯(SiE)脂质分子数量也相对较高。筛选出脂质分子DG(29:1)、SQDG(17:5/23:2)、SQMG(16:0)、MGMG(16:0)和 MGDG(16:1/18:3)可作为发菜响应干旱胁迫的生物标志物。在发菜差异脂质分子比较分析中发现,与对照组相比,失水30%、75%和100%发菜中分别有到64个(31个上调,33个下调)、94个(69个上调,25个下调)和98个(75个上调,23个下调)差异脂质分子。随着干旱胁迫的加剧,不同类型的甘油磷脂数量减少,并伴随着溶血磷脂数量的增加。发菜DGDG/MGDG 比值的增加调节膜脂组成、脂酰基不饱和度和膜流动性响应干旱胁迫。DGDG生物合成途径中酶活性显著上调,有助于DGDG积累增强发菜抗旱性。干旱胁迫下发菜光合作用降低,通过提高不饱和脂肪酸含量增强膜的稳定性,从而维持类囊体膜结构完整。发菜抗氧化脂质Co(Q10)在干旱胁迫下显著积累,有利于减轻发菜的脂质过氧化作用,并通过脂质降解产生大量能量以及合理分配底物以响应干旱胁迫。此外,奇数链脂肪酸(OCFA)水平的提高也是发菜响应干旱胁迫的一个重要策略。4.发菜响应干旱胁迫的多组学联合分析丙二酰化修饰组与代谢组联合分析表明,差异丙二酰化修饰蛋白和差异代谢物有22条共同注释代谢通路,其中,注释到差异修饰蛋白和差异代谢物数量最多是Hepatocytes injuryABC转运体。KEGG通路进行富集分析发现,嘌呤代谢及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径在两个组学中活跃度较高,是发菜蛋白质丙二酰化修饰水平和代谢物水平对干旱胁迫响应的共同特征。丙二酰化修饰组、代谢组及脂质组进行联合分析表明,干旱胁迫下发菜的差异丙二酰化修饰蛋白、差异代谢物及差异脂质分子间具有复杂的调控关系,从不同维度共同参与发菜光合作用、渗透调节及抗氧化防御等过程的调控进而响应干旱胁迫。上述结果初步揭示了发菜在干旱胁迫下的丙二酰化selleckchem Z-VAD-FMK修饰组与代谢组的生理及分子调控机理。发菜应对干旱胁迫的响应机制是一个复杂的过程,通过多维度调控协同发挥作用。本研究结果有助于阐明陆生蓝藻耐旱机制及进化机理,并为其它植物,尤其是低等植物耐旱机制研究提供参考,同时,对干旱、半干旱地区特色植物资源保护与开发利用、耐旱种质资源创新和生态保护等具有积极促进作用。