三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)具有发病年龄轻、恶性程度高、侵袭性强、易局部复发、转移等特点,一经发现临床分期较晚,严重威胁女性生命、健康。目前临床上缺乏有效的三阴性乳腺癌诊疗手段。这一现状推动了更精确、更有效治疗策略的发展。在众多新方法中,外部非侵袭性能量(声、光等)触发肿瘤消融被视作最具发展前景的新治疗模式。其中光热治疗(Photothermal therapy,PTT)受到越来越多关注,它是借助光热转化剂将特定波长激光的光能转化为热能,通过热效应原位灭活肿瘤的方法。但由于PTT对深部组织穿透能力有限、受热不均匀等原因,使得PTT在深部、大肿瘤中应用受到限制。声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)是在低强度超声照射下使用声敏剂产生细胞毒性活性氧的一种新的癌症治疗方法,可以克服光热治疗组织穿透障碍,但肿瘤缺氧微环境降低了其治疗效果。将PTT与SDT两种方法整合,可以实现两者非常理想的优势互补,进而改善单一治疗效果有限的不足。超声成像在乳腺疾病诊断与治疗监测中起着重要作用,构建基于超声影像的诊疗一体化平台,可为三阴性乳腺精准诊疗提供新的方向。然而多功能的诊疗一体化平台构建需要基于纳米材料来执行不同的功能。金属有机框架(Metal-organic frameworks,MOF)是目前发展十分迅速的一类新型多孔晶体材料,由于结构可控性、可裁剪性以及超高比表面积、良好生物相容性、生物降解性等优越的理化性质,在生物医学领域表现出巨大的潜力。考虑到MOF材料独特理化性质可能影响生物医学特点,本研究把该材料作为理想的候选材料。因此本研究目的是基于纳米级MOF材料,设计合成具有光热/实时超声造影成像和光热-声动力联合治疗功能的诊疗一体化材料,通过双模态成像辅助光热/声动力协同治疗手段实现三阴性乳腺癌的诊疗优化。本研究主要内容包括以下三部分:1.锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球的结构设计、合成及表征方法:通过溶剂热法结合高温退火法合成锌硼咪唑框架衍生物纳米碳球,表征其基本理化性质。使用扫描电子显微镜和透射电镜观察合成纳米粒子形貌。用ZS90型纳米粒度及zeta电位分析仪测试纳米粒子流体力学直径。通过能量色散光谱法、X射线光电子能谱分析法等检测纳米粒子构成元素。使用近红外激光持续辐照纳米粒子分散液,用红外热成像仪监测温度变化,并通过温度变化值与冷却阶段数据拟合值计算光热转换效率,以探索锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球在808 nm近红外光辐照下的可控光热转换能力。通过荧光染色法、电子顺磁共振法(ESR)测试激光和低强度超声辐照纳米粒子过程中单线态氧(~1O_2)的产生。结果:合成的锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球比表面积约为1800 m~2/g,孔容约为0.7 m~3/g,平均孔径约为1.6 nm,具有较大的比表面积和优异的微孔特性。在808 nm近红外光辐照下,锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球的光热转换效率可达38.7%,同时在低强度超声辐照下,其能够产生大量有细胞毒性的单线态氧。2.锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球用于光热-声动力联合治疗三阴性乳腺癌(1)体外实验方法:以MDA-MB-231人源三阴性乳腺癌细胞为模型,采用CCK-8试验检测锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球对细胞增殖与毒性的影响。将MDA-MB-231细胞分为(i)空白对照组;(ii)锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球组;(iii)808nm近红外激光辐照组(2.0 W/cm~2;10 min);(iv)低强度超声组;(v)光热治疗组;(vi)声动力治疗组;(vii)光热-声动力联合治疗组。采用CCK-8试验、钙黄绿素-碘化丙啶(Calcein-AM/PI)活死细胞双染法、流式细胞仪检测锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球介导的光热-声动力联合治疗对各组细胞增殖与毒性的影响。采用2,7-双氯荧光素蛋白乙酸盐活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球介导的光热-声动力联合治疗后各组细胞内活性氧自由基的产生。结果:CCK-8试验结果显示锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球对NIH3T3、HUVEC和更多Hela等细胞没有产生明显的毒性,当分散液浓度为100μg/m L时,细胞存活率仍保持在95%以上。MDA-MB-231细胞在808 nm激光和低强度超声照射后,CCK-8试验结果显示细胞存活率分别下降到53.0%和64.5%。特别是在近红外照射和低强度超声同时治疗下,MDA-MB-231细胞的相对细胞活力降低更为显著,下降约13.6%(~(***)p<0.001)。Calcein-AM/PI荧光染色实验显示在未有激光和超声辐照的对照组的样本中绝大多数细胞活性好、生长旺盛,染色结果呈现致密浓染的绿色强烈荧光;而在808 nm激光和低强度激光共同辐照下与锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球共培养的三阴性乳腺癌细胞中死亡细胞的比例大大提高、均呈现致密浓染的红色荧光。流式细胞仪定量分析显示光热-声动力联合治疗组细胞处理后凋亡细胞的百分率约为83.8%。(2)体内实验方法:以MDA-MB-231荷瘤裸鼠为模型,将42只荷瘤裸鼠分为(i)空白对照组;(ii)锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球组(100μL;20 mg.kg~(-1));(iii)808 nm近红外激光辐照组(2.0 W/cm~2;10 min);(iv)低强度超声组;(v)光热治疗组;(vi)声动力治疗组;(vii)光热-声动力联合治疗组。对各组荷瘤裸鼠施以不同受试处方后,通过瘤体体积监测、组织学形态及组织蛋白检测等方法评价锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球介导光热-声动力联合治疗实体肿瘤效果。结果:治疗周期内,光热-声动力联合治疗组的实体肿瘤体积急剧收缩,对照组的实体肿瘤的相对体积持续增长。治疗周期结束后光热-声动力联合治疗组平均肿瘤质量最小(***p<0.001);苏木精和伊红(H&E)染色对各组肿瘤的病理学组织形态分析显示肿瘤经过光热和声动力处理后的组织形态明显不同于对照组,表现为广泛的核皱缩和松散排列的死亡细胞;各组肿瘤组织免疫组化检测结果显示光热-声动力联合治疗组Ki-67蛋白表达减少的最为明显;各组肿瘤组织的TUNEL检测结果显示光热-声动力联合治疗组凋亡和坏死细胞的比例显著增加。以上结果均表明光热-声动力联合治疗LXH254组肿瘤增殖明显受到抑制。治疗周期结束后,各组荷瘤鼠血常规和血生化检测结果显示指标均在参考范围内,小鼠的主要器官组animal models of filovirus infection织病理学分析图也没有发生明显的组织形态变化。3.锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球用于对比增强超声成像及体内光热成像(1)体外对比增强超声成像方法:用低强度超声(功率2.5W/cm~2)辐照不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25、50μg/m L)锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球分散液5 min,彩色多普勒超声仪超声造影模式下观察纳米粒子对比增强超声成像能力。结果:在彩色多普勒超声仪超声造影模式下可以观察到含锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球分散液呈高增强信号,且随分散液浓度的增加信号强度也逐渐增强,两者呈正相关(R~2=0.998)。(2)体内对比增强超声成像方法:以MDA-MB-231荷瘤裸鼠为模型,将12只荷瘤裸鼠分为2组(每组n=6),经尾静脉途径分别注射锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球分散液和医用六氟化硫微泡(声诺维)。彩色多普勒超声仪超声造影模式下观察超声成像情况。结果:在注射锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球之前,瘤体内无超声信号;而在注入锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球后瘤体内可见超声回声信号,且随时间的延长超声增强信号逐渐明显。与六氟化硫微泡相比,锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球超声增强效果更佳,且随着时间逐渐延长,六氟化硫微泡增强信号逐渐消失,但锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球超声增强信号可持续至2 h,然后逐渐减弱。(3)体内光热成像方法:以MDA-MB-231荷瘤裸鼠为模型,经尾静脉途径向荷瘤裸鼠体内注射锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球分散液,808 nm近红外激光(1.0 W/cm~2)持续辐照肿瘤10 min,通过红外热成像仪获取实时热图像。结果显示在10 min内,荷瘤鼠实性肿瘤区域温度迅速升高到53.2℃左右,显著高于PBS对照组(35.6℃)。综合以上结果,得出以下结论:(1)通过溶剂热法结合高温退火法成功合成了具有超高比表面积和多孔结构的锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球,该纳米粒子具有良好的声学性能和光热性能,具有用于光热-声动力联合治疗的潜力。(2)体外、体内实验证明锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球具有良好的生物相容性。仅体内注射纳米药物一次,在808 nm近红外光和低强度超声辐照下即可实现99.3%的实体肿瘤消融率。同时光热-声动力联合治疗效果相对于光热或声动力单一治疗效果得到了极大地提升。(3)通过低强度超声辐照,锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球内的空气核在快速增长、急剧收缩和崩溃过程中具有超声造影成像功能。相比于声诺维等商用微泡超声造影剂,锌硼咪唑框架衍生纳米多孔碳球具有体内循环时间长、超声成像效果好的特点,可用于搜寻实体肿瘤的位置并实时监测联合治疗效果。同时,其成像效果可通过调节纳米材料浓度等多因素按需调控。