目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最普遍的一种原发性肝癌,全球排名第五。大多数HCC患者预后不良,因为早期诊断有限,且晚期肝细胞癌的有效治疗方案较少。即使积极治疗,如肝移植、切除、经皮消融、经动脉化疗栓塞,HCC仍有可能复发和转移,5年生存率不到20%。此外,传统的化疗和分子靶向药物都受到肿瘤异质性以及肿瘤中可能产生的固有和获得性耐药性的阻碍。这些特征限制了HCC患者全身治疗的功效。因此,迫切需要研究新的策略来改善HCC患者的临床结果。目前,肠道菌群被公认为是除心肝脾肺肾外的一种虚拟器官,与大脑、心血管、肾脏、骨骼系统等肠外器官形成相应的轴,成为研究的焦点。近几年,肠-肝轴的研究越来越被学者们关注。肠道菌群与肝脏之间的互利关系是由代谢、免疫和神经内分泌之间等复杂的相互作用网络稳定调节的。肠-肝轴可调控肝脏相关疾病的发病机制,是Fulvestrant当前临床研究的一个重要热点。据报道肝肠轴在HCC的发病机制中起着关键作用,但HCC患者肠道菌群对临床结局的影响尚不清楚,肠道菌群与肝细胞癌HCC肝动脉化疗栓塞(Hepatic arterial chemoembolization,TACE)术治疗之间的相互联系仍需进一步阐明。代谢组学是系统生物医学领域中一个起着承上启下的过度平台,主要专注于小分子对生物体干扰的动态变化。非靶向代谢组学主要在临床医学领域用于发现生物代谢标志物以及肿瘤相关致癌机制研究,在慢性肝病(Chronic liver disease,CLD)和HCC的相关研究中代谢组学方法也是常用的检测手段。据报道,鞘氨醇、氨基酸、胆汁酸等血清、粪便或尿液的代谢物,是CLD或HCC潜在的生物学标志物。可见,患者的血清、尿液和粪便通常是反映全身整体系统代谢紊乱的代谢物库,这些样本中的复杂多变的标记物可以反映疾病过程中系统的特征。烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)的一种前体代谢物。烟酰胺(Nicotinamide,NAM)是烟酸的一种酰胺衍生物。肉、鱼、蛋、豆类、蘑菇、坚果和谷物等食物中都含有烟酰胺。NAM通过色氨酸代谢从头合成,摄取后易被消化道胃肠吸收,广泛分布于生物体的组织中。NMN可通过烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase,NMNAT)催化并利用ATP直接合成。NAD+是一种可以在体内大量合成产生的与产能相关的代谢物,具有维持机体细胞稳态、保证机体生命进程有序进行的功能。据报道NAD+对肝癌、皮肤癌有预防作用,但NMN对肝细胞癌的发展进程影响尚不明确。本研究主要探讨烟酰胺单核苷酸(NMN)在肝癌中的作用及机制,为开发新的肝癌治疗策略提供依据。研究方法:第一部分原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞(TACE)术治疗术前术后肠道菌群结构及代谢物变化的初步研究(一)首先通过对30例原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞(TACE)术治疗术前术后粪便样本,通过高通量测序,分析评估肝癌患者术前术后肠道菌群结构变化;(二)通过对30例人肝癌患者术前和手术后粪便样本进行广泛靶向代谢组学检测,比较肝癌患者术前术后粪便样本代谢途径变化情况,筛选出差异代谢通路进行后续研究。第二部分:通过细胞实验进一步探讨烟酰胺单核苷酸(NMN)在肝癌中的作用及机制研究(一)首先利用低、中、高剂量的酰胺单核苷酸(NMN)干预肝癌细胞Hep G2和Huh-7,采用NAD+浓度检测试剂盒检测细胞内NAD+浓度变化;CCK-8检测细胞增殖变化,Hoechst染色检测凋亡情况;Western blot检测肝癌细胞中凋亡相关蛋白的表达变化;caspase-3和caspase-9活性试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,探讨烟酰胺单核苷酸(NMN)对肝癌细胞增殖和凋亡的影响;(二)为了研究烟酰胺单核苷酸(NMN)对肝癌细胞自噬的影响,利用低、中、高剂量的酰胺单核苷酸(NMN)干预肝癌细胞Hep G2和Huh-7后,采用Western blot检测细胞中LC3B(计算LC3B-II/LC3B-I比值)、Beclin 1、ATG5和p62的表达。(三)为了研究烟酰胺单核苷酸(NMN)对肝癌Hep G2和Huh-7细胞铁死亡的影响,不同浓度的NMN干预Hep G2和Huh-7肝癌细胞后,试剂盒方法检测细胞内ROS、MDA、SOD与GSH水平及细胞内铁离子水平;通过Real-time PCselleckchem Z-IETD-FMKR检测细胞中ACSL4、SLC7A11和GPX4的表达水平;通过Western blot检测细胞中ACSL4、SLC7A11和GPX4的表达水平。(四)为了进一步研究烟酰胺单核苷酸(NMN)对AMPK/m TOR信号通路的影响,不同浓度的NMN干预细胞后,Western blot检测细胞中AMPK、p-AMPK、m TOR、p-m TOR、p70S6K和p-p70S6K的表达。(五)敲低AMPK探讨烟酰胺单核苷酸(NMN)的抗癌作用,进行回复实验的验证。AMPK si RNA转染细胞后,H-NMN(高剂量NMN)处理细胞后,Western blot检测肝癌细胞中自噬相关蛋白LC3B、p62与铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4的表达;Hoechst染色检测肝癌细胞凋亡;试剂盒检测肝癌细胞内ROS水平、MDA含量、SOD活性、GSH水平及细胞内铁离子水平。第三部分动物水平验证烟酰胺单核苷酸(NMN)对人肝癌异种移植瘤的影响构建人肝癌细胞系裸鼠移植瘤模型;NMN给药灌胃,连续给药3周,试剂盒检测肿瘤组织中NAD+浓度和NAD+/NADH比值;HE检测裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞的病理形态;免疫组化检测瘤体组织增殖相关Ki-67,PCNA蛋白的表达分布;TUNEL染色(荧光法)检测瘤体组织细胞凋亡情况。结果:在第一部分研究中,(1)我们对30名原发性肝癌患者TACE术前EG组与术后CG组的粪便样本进行16S r RNA高通量测序,最终获得有效序列共4312319条,99%平均序列长度分布在400-430 bp。利用Vsearch软件进行聚类分析,得到用于物种分类的OTUs,本研究共获得OTUs 10856个;通过α多样性分析发现EG组Chao1、observed species及Faith＿pd指数均高于CG组,揭示术后肝癌患者肠道微生物多样性减少;通过β多样性分析发现肝癌患者CG组和EG组肠道菌群的β多样性存在显著差异;使用LEf Se分析(LDA Effect Size)发现红杆菌目(Rhodobacterales)、红杆菌属(Rhodobacteraceae)等10个菌属在EG组中分布显著高于CG组;(2)通过30例肝癌患者TACE术前(EG)术后(CG)粪便样本代谢组学差异代谢物筛选,得到CG组相对于EG组具有显著性差异的差异代谢物74个,24个代谢产物水平下调,50个代谢产物水平上调,其中NAD+在术后显著上调;根据KEGG数据库路径分析,发现8条主要代谢通路;微生物组学与代谢组学联合分析发现术前术后肠道菌群微生物改变与烟酸及烟酰胺代谢具有显著差异。因此我们选择烟酸和烟酰胺代谢途径先进行后续基础研究,选择烟酸及烟酰胺代谢途径的中间体烟酰胺单核苷酸NMN进行研究,探讨NMN在肝细胞癌HCC中的作用及机制。第二部分:细胞水平验证烟酰胺单核苷酸(NMN)在肝癌中的作用及机制研究。(1)研究发现NMN可上调肝癌Hep-G2与Huh7细胞中NAD+浓度和NAD+/NADH比值;(2)增殖凋亡检测结果表明NMN可抑制肝癌Hep-G2IVIG—intravenous immunoglobulin与Huh7细胞增殖,促进肝癌Hep-G2与Huh7细胞凋亡;NMN促进凋亡相关蛋白Bax和cleaved PARP的表达,抑制Bcl-2蛋白表达;此外NMN可促进肝癌HepG2与Huh7细胞caspase-3和caspase-9活性,进一步说明NMN抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡;(3)自噬检测结果发现NMN可上调肝癌Hep-G2与Huh7细胞LC3B-II/LC3B-I比值,上调Beclin 1和ATG5蛋白表达,下调p62蛋白表达;(4)铁死亡相关检测结果表明NMN上调Hep-G2与Huh7肝癌细胞中ROS和MDA水平,下调SOD活性和GSH水平,上调铁离子水平,同时NMN增加Hep-G2与Huh7肝癌细胞中ACSL4蛋白表达,减少SLC7A11和GPX4蛋白表达,揭示NMN可促进肝癌细胞铁死亡;(5)AMPK/m TOR信号轴分子机制相关检测结果发现NMN可上调Hep-G2与Huh7肝癌细胞中p-AMPK(Thr172)的表达,下调p-m TOR(Ser2448)及p-p70S6K(Thr389)蛋白的表达,表明NMN可能通过AMPK发挥作用;为了进一步验证NMN通过AMPK通路发挥作用,采用敲低AMPK(AMPK si RNA)进行回复实验验证。结果发现AMPK si RNA可逆转NMN调控的Hep-G2与Huh7细胞LC3B-II/LC3B-I比值的上调、Beclin 1和ATG5蛋白表达的上调,逆转NMN调控的细胞凋亡与ROS水平、MDA含量、SOD活性、GSH水平及细胞内铁离子水平。第三部分:动物水平验证烟酰胺单核苷酸(NMN)在肝癌中的作用:NMN可抑制人肝癌细胞系裸鼠移植瘤的生长,并上调肿瘤组织中NAD+浓度和NAD+/NADH比值;HE结果表明NMN中剂量组、NMN高剂量组肿瘤组织中细胞坏死逐渐加重,NMN高剂量组肿瘤组织中细胞坏死最严重;IHC检测瘤体组织增殖相关Ki-67,PCNA蛋白的表达分布,结果发现NMN高剂量组肿瘤组织中Ki-67,PCNA蛋白的表达减少;TUNEL染色检测瘤体组织细胞凋亡情况发现烟酰胺单核苷酸(NMN)可促进人肝癌细胞系裸鼠移植瘤模型肿瘤组织中细胞的凋亡。结论:1.肠道菌群分析表明,肝癌患者术后肠道微生物多样性减少;通过β多样性分析发现术前肝癌患者(CG组)和术后肝癌患者(EG组)肠道菌群的β多样性存在显著差异;术后肝癌患者肠道菌群优势有益菌群拟杆菌属(Bacteroides)与副拟杆菌(Parabacteroides)显著减少。2.代谢组学分析得到CG组相对于EG组具有显著性差异的差异代谢物74个,24个代谢产物水平下调,50个代谢产物水平上调,其中NAD+显著上调;根据KEGG数据库路径分析8条主要代谢通路;微生物组学与代谢组学联合分析发现术前术后肠道菌群微生物改变与烟酸及烟酰胺代谢具有显著差异;原发性肝癌患者肝动脉化疗栓塞(TACE)术治疗导致肠道菌群发生改变,可能是由于一些有害菌如莫拉氏菌科(Moraxellaceae)及霍尔德曼氏菌(Holdemania)的减少,激活烟酸及烟酰胺代谢途径,升高NAD+,进而发挥抗癌作用,因此我们选择烟酸和烟酰胺代谢途径先进行后续基础研究,选择烟酸及烟酰胺代谢途径的中间体烟酰胺单核苷酸NMN进行后续基础研究。3.在细胞水平验证了烟酰胺单核苷酸NMN通过激活肝癌细胞AMPK信号通路,抑制m TOR/p70S6K通路,激活自噬,促进铁死亡,进而抑制肝细胞癌增殖、促进肝细胞癌凋亡。4.在动物水平验证了烟酰胺单核苷酸(NMN)通过上调肿瘤组织中NAD+水平,抑制人肝癌细胞系Hep-G2裸鼠移植瘤肿瘤的生长,促进肝细胞癌的凋亡。